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第一部分
应用生物信息学预测GR mRNA是mmu-miR-30a的可能靶基因
目的:预测miRNA靶基因是否为糖皮质激素受体(Glucocorticoid Receptor,GR) mRNA。
方法:使用miRBase(http://www.mirbase.org)获得miR-30a基因序列;使用Pubmed(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)获得基因NR3C1序列;分别使用miRanda、TargetScan、PicTar生物信息学软件对mmu-miR-30a的靶基因进行寻找与预测。
结果:miRanda、TargetScan和PicTar均预测到mmu-mir-30a的靶基因为糖皮质激素受体(Glucocorticoid Receptor,GR)mRNA。
结论:GR mRNA是mmu-miR-30a的可能靶基因
第二部分
小鼠足细胞中GRα及mmu-miR-30a的表达变化
目的:探讨GRα与mmu-miR-30a在小鼠足细胞系MPC5(mouse podocyte clone5,MPC5)中的表达变化。
方法:
条件永生型小鼠足细胞系MPC5培养:将复苏MPC5细胞于33℃中增殖培养,平均3~4天达90%以上融合传代。换于37℃中培养,10~14天分化为成熟,此时为分化态MPC5;将以上两种细胞分为两组,通过反转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫蛋白印迹(Western-blot)、免疫荧光显微镜检测Nephrin、Synaptopodin、GRα在未分化态与分化态MPC5中的表达,观察变化:通过实时荧光定量PCR反应(qRT-PCR)检测mmu-miR-30a在未分化态与分化态MPC5中的表达,观察变化;
结果:
MPC5细胞在33℃有γ-INF的1640培养液中生长,细胞体小而突起,细胞间排列紧密,呈鹅卵石样,部分区域有管腔样结构,足突样结构少见,平均3~4天即达到90%融合,在37℃无γ-INF条件培养下的足细胞较33℃的胞体透明,呈多角形,细胞间相对疏松,管腔样结构增多,生长速度明显减缓,3~4天后细胞即停止增殖,1周后星型细胞样细胞形成,树枝状的足突结构明显,可见细胞间足突互相接触,10~14天分化成熟。RT-PCR、Western-blot、免疫荧光显微镜显示,nephrin在33℃未分化足细胞和37℃分化足细胞中均有表达,37℃分化足细胞中表达显著增加(P<0.01);Synaptopodin在33℃未分化足细胞中几乎未见表达;而在37℃分化足细胞中表达明显(P<0.01)。GRα在33℃未分化足细胞和37℃分化足细胞中均有表达,37℃分化足细胞中表达显著增加(P<0.01);qRT-PCR检测显示,mmu-miR-30a在33℃未分化足细胞和37℃分化足细胞中均有表达,37℃分化足细胞中表达显著增加(P<0.01)。
结论:
GRα和mmu-miR-30a在33℃未分化态和37℃分化态MPC5中均有表达,且37℃分化态MPC5表达强。