真核生物细胞膜是一种具有半透性的生物膜,构成了细胞内、外物质选择性交换的结构基础,因而对于维持细胞的生存和正常功能的发挥具有关键性作用。然而,由于存在着这一天然屏障,一些被证明具有良好治疗效果和疾病诊断价值的生物大分子,例如非脂溶性的蛋白、抗体、多肽、核酸、极性药物分子、探针以及显像剂等却很难到达细胞内发挥应有的作用。近十几年来,细胞穿透肽(cell-penetrating peptides,CPPs)陆续发现,并得到深入研究,这一领域开启了细胞内输送载体研究的新纪元,CPPs亦被证明是目前实现细胞内运输最为有效的手段之一。大量的研究证实,CPPs可以有效地将亲水性蛋白质、多肽、核酸、极性化学分子甚至量子点等,导入多种细胞中,不仅能够保证活性分子正常发挥作用,并且在一定浓度范围内不会造成细胞损伤。尤其是某些CPPs能够携带货物分子穿过血脑屏障、血睾屏障、胎盘屏障等人体重要的屏障系统发挥作用。因而,CPPs作为有效的细胞内转运工具,在细胞生物学、细胞免疫学、药物开发、基因生物治疗以及肿瘤靶向治疗等研究领域,均具有广阔而重要的应用前景。CPPs的发现为细胞膜结构和功能的研究提供了极佳的研究工具,因此,对于其穿膜机制的研究也得到了广泛关注。目前普遍认为,CPPs穿透细胞膜的过程基本上可分为两个阶段:首先通过电荷作用与细胞表面上带有阴离子的胺聚糖、膜磷脂头部等发生强烈的相互作用,从而在细胞膜表面聚集;然后穿透细胞膜进入细胞,释放进入胞浆乃至胞核。因此,氨基酸序列中含有较多的正电荷是大多数穿透肽的序列特征之一。在第二阶段中,CPPs内化的机制主要涉及两类条途径,一是内吞非依赖型,即CPPs通过直接穿膜或在细胞表面形成特定的跨膜结构实现转运,比如,打孔模式(pore formation),地毯模式(carpet-like perturbations)和微团模式(inverted micelles)等;二是内吞介导的内化模式,其中又可能涉及网格蛋白(Clathrin)、胞膜窖(Caveolin)和巨胞饮介导等具体内吞方式。上述两条途径中,内吞介导的内化模式目前被认为是大多数CPPs进入细胞的主要途径,也是研究最深入的一条途径。但是对于某一条CPPs的穿膜途径而言,由于实验方法和条件的不一致,不同的研究机构和组织往往得到了不同的结论。另外,有研究发现,CPPs乃至货物分子的长度、电荷、浓度乃至细胞类型等都会对其具体的穿膜机制产生影响。由于上述因素的存在,加之研究手段的有限以及实验条件的差异,使得对于CPPs穿膜机制的研究变得异常复杂。目前,已经得到报道的CPPs已有上百条之多,其来源主要包括转录因子、病毒蛋白、信号肽、抗菌肽以及人为设计合成等几大类。由于部分天然来源的CPPs具有效率差异、缺乏细胞特异性等缺点,利用现代生物信息学方法,根据CPPs的天然结构,通过分子模拟和分子设计对其进行预测和改造,已经成为CPPs研究的一项重要方向。已有一些实验室依据某些CPPs的结构,合成得到了较原有分子穿膜性能更强的序列。但是从总体上来看,已发现的CPPs具有分布广泛、长度不一、序列特征和来源各异等结构特点。迄今为止,对于CPPs结构特征的规律性认识主要包括以下几个方面:大多数分子含有精氨酸和赖氨酸(在生理条件下带有相当数量的正电荷);分子中含有一定的兼性(α-螺旋或β-折叠)以及疏水性结构等。鉴于对CPPs结构特征认识的局限性,使得对于CPPs分子改造以及预测工作缺乏有效的依据和明确的方向。除了机制和结构认识上的不足,当前CPPs在应用领域也面临着一些障碍,体现出了一定的局限性。首先,体内实验显示多肽会在接触或通过上皮细胞和内皮细胞内酶体系时被快速地代谢降解清除。由于代谢稳定性是影响其生物利用率的重要因素,关于CPPs降解和稳定性研究的重要性日益突显,但是相关领域的成果却十分有限。另外,有研究发现,CPPs在“渗漏(leaky)”和“非渗漏(non-leaky)”细胞模型培养物中的穿膜能力存在显著的差异。所谓“leaky”细胞模型,如Hela细胞,是指不能形成紧密连接(tight junctions,TJs),而生长成为具有高可渗透单层的细胞。而“non-leaky”的上皮细胞细胞模型,如融合的狗肾MDCK单层细胞,则是指细胞之间的连接通过形成TJs来实现。由于人体的消化道、呼吸道以及循环系统中存在着能够形成TJs结构的上皮和内皮细胞,增加了 CPPs携带药物分子穿透屏障到达体内的难度。为了克服现有的缺陷,除了在现有序列上进行修饰和改造,寻找具有更加优良特性的CPPs也变得尤为必要。噬菌体展示是一种用于筛选功能性多肽的蛋白质组学生物技术,通过将外源多肽或蛋白与噬菌体的衣壳蛋白相融合表达,实现了表型(pheno-type)(蛋白质)与基因型(gene-type)(DNA)的有效统一。由一定长度的随机肽段混合组成的噬菌体随机肽库,理论上包含了该长度所有可能的氨基酸排列信息。将噬菌体随机肽库加入到固定有特定的靶分子(靶细胞)的体系中,如果展示在噬菌体表面的多肽能够与靶分子(靶细胞)发生有效的识别与结合,那么该噬菌体颗粒将被附着在受体的表面,从而与大量不存在结合的噬菌体相分离。通过几轮生物淘洗(biopanning)后,就能高效、快速、简便地从噬菌体随机肽库中筛选到展示有特异性结合肽的噬菌体。通过裂解噬菌体,提取DNA,经过PCR反应和测序,就能获取结合肽的氨基酸序列信息。在本论文中,我们利用该技术将CPPs穿膜特性与噬菌体的可扩增性结合在一起,通过全细胞淘选模式,裂解获取并富集可内化进入细胞中的噬菌体,获得大量具有穿透细胞膜特性的多肽,进而构建得到具有序列信息多样性的CPPs原核表达文库。并在此基础上,利用生物信息学强大工具完成对高通量筛选方法获取大量数据的整理和分析。前列腺癌(Prostate cancer)是男性泌尿生殖系常见恶性肿瘤之一,在美国位居男性恶性肿瘤之首,占男性死亡原因的第二位。随着我国人民的饮食结构和生活习惯与西方差别的逐渐缩小,前列腺癌在我国的发病率也逐年增加。雄激素阻断疗法(去势疗法)治疗前列腺癌,可以抑制肿瘤,且绝大多数患者大约可无病生存1.5～3年,但此后,肿瘤往往复发,获得雄激素非依赖性增殖的能力。通常,临床上将雄激素完全阻断后仍有进展的前列腺癌称为雄激素非依赖性前列腺癌(androgen-independent prostate cancer,AIPC)或雄激素抵抗性的前列腺癌(castration-resistant prostate cancer,CRPC)。AIPC 发生发展的机制并不清楚。近年,随着前列腺癌的发病率增加,以及新技术的应用,人们发现microRNA(miRNA)对其靶基因表达的调控,在AIPC的发生发展中起到重要的调控作用。在前期的工作中,我们首先用Q-PCR方法筛选了一些miRNA和肿瘤相关基因在PC-3细胞和LnCap细胞中的表达差异。在差异表达的miRNA中miR-200b-3p在PC-3中表达显著较低,而TP73(编码蛋白p73)表达变化趋势与miR-200b-3p 一致。p73参与DNA损伤引起的凋亡,可能是一种肿瘤抑制蛋白。Western-blot实验及免疫组化实验表明2例ADPC组织中有微弱p73表达,而AIPC组织中没有p73表达。我们的结果还显示,p73的在前列腺癌细胞中表达与miR-200b-3p呈正相关。采用转染pcDNA3/HA-TP73真核表达载体的策略使PC3-Ad细胞过表达p73,发现miR-200b-3p表达随之增高。而当采用RNAi技术瞬时抑制p73在LnCap-Ad细胞中表达时,miR-200b-3p表达也随之降低。因此,我们得出结论,miR-200b-3p表达受到p73调控,二者的下调共同导致了 AIPC细胞PC-3的增殖。鉴于pDHY对于前列腺癌细胞PC-3具有较高的内化活性,我们考察了 pDHY携带凋亡相关的蛋白、质粒DNA(pcDNA3-TP73)以及RNAoligo(MiR-200b)进入人前列腺癌PC-3细胞的效率和生物活性,探索未来利用pDHY进行前列腺肿瘤研究和治疗的应用前景。本研究工作取得以下几个方面的结果:(一)利用噬菌体随机肽库技术结合全细胞筛选模式,成功富集并筛选得到能够内化Hela细胞的噬菌体,实验结果显示筛选回收率逐轮提高,富集效果理想;(二)综合考虑“筛选的富集程度”和“序列的多样性”的平衡,利用第三轮筛选产物作为模板,设计载体上的通用引物,通过PCR方法,将包含大量CPPs信息的DNA片段集体插入原核表达载体中,构建得到融合有增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein,EGFP)的细胞穿透肽的原核表达文库;(三)挑取文库中的单克隆,通过原核蛋白的表达纯化获得CPPs与EGFP的融合蛋白,通过荧光观察实验验证其内化能力。结果显示,文库克隆的阳性率(经验证确为CPPs的比例)高达70%,共计获得了 152条能够内化Hela细胞的独立穿透肽序列;(四)利用生物信息学工具软件对152条穿透肽序列进行了理化性质、聚类以及特征性基序分析。发现文库中序列的pI值分布在3.00～12.99之间,弱碱性(pH8.00～9.99)和弱酸性(pH5.00～6.99)范围较为集中,少量序列的等电点偏较强酸性;净电荷主要分布在-1、0和+1的范围,带有较多正电荷和负电荷的序列较少;总平均疏水指数分布区间为-3.999-3.000,其中-1.999-0.000之间分布较为集中,即呈弱亲水性。上述理化性质与目前CPPs结构特征的认识存在差异。从序列聚类结果上看,这152条CPPs可以归纳为三大类,提示处于同一类别中的CPPs具有较高的序列相似性。短肽拆分获得70条特征性三肽序列,并获得了包含该三肽的具有特征性的四肽、五肽和六肽基序,这些基序可能就是实现CPPs内化功能的最小转运单位(motor sequence)。(五)考虑到文库中丰度最高的穿透肽pDHY生理条件下带有负电荷,具有弱亲水性,理化性质区别于大多数已报道的CPPs。我们选择pDHY作为研究对象,采用研究最为透彻的经典穿透肽-Tat作为对照,在相同实验条件下,考察二者在内化特点(分布、细胞毒性、细胞特异性和代谢)和机制方面的异同。首先,pDHY和Tat均能以时间和浓度依赖性发生内化,二者动力学过程特点基本一致,并且具有内化的细胞普遍性;但是从内化的细胞分布特点上看,pDHY无法进入到细胞核,Tat却能在核仁区出现聚集,这种差异在包括人前列腺癌细胞株PC-3、人神经母细胞瘤细胞系SH-SY-5Y、人肺腺癌上皮细胞系A549、小鼠胚胎成纤维细胞系3T3、人脐静脉内皮细胞系HUVEC和乳鼠原代心肌细胞等模型中也同样观察到。但是二者在小鼠单核巨噬细胞系Raw 264.7中内化表现却基本类似。其次,台盼蓝染色实验结果显示,与Tat相类似,pDHY在相当宽的浓度范围内对哺乳动物细胞膜的完整性无影响,具有较高的使用安全性。该数据运用SPSS 13.0软件进行统计学分析,采用One-way ANOVA方法,pDHY处理组方差分析结果F=0.600,P=0.700,差异无统计学意义。Tat处理组方差分析结果F=0.371,P=0.863,差异无统计学意义。然后,荧光观察发现当携带类似EGFP(分子量27kDa)的大分子货物时,Tat主要存在于内吞体中,代谢较快,而pDHY则主要以弥散状态存在,代谢较慢。Tat-EGFP在细胞内的半衰期大概在2-3h,而pDHY-EGFP在细胞内的半衰期可以达到近6h。上述结果提示,在相同条件下,pDHY携带大分子内化后其稳定性较Tat强。该数据运用SPSS 13.0软件进行统计学分析,不同处理组不同时间点对细胞荧光强度的影响采用析因设计资料的方差分析。同一时间点的两处理组间比较采用随机设计的t检验。统计结果显示,不同处理组之间荧光强度差异具有统计学意义(F=233.331,P<0.001),代谢的不同时间点之间荧光强度差异具有统计学意义(F=177.582,P<0.001),不同处理组和代谢不同时间点之间存在交互效应(F处理*时间=10.128,P<0.001),同一时间点pDHY-EGFP处理组的细胞荧光强度均高于Tat-EGFP处理组,差异均具有统计学意义(P<0.001)。最后,机制研究发现二者的内化均为能量非依赖过程,同时无需Ca2+等二价阳离子的存在,但pDHY的内化作用不依赖其与细胞膜表面的静电吸附。内化抑制剂和胞膜/浆蛋白串联亲和纯化实验提示,pDHY的内化强烈依赖细胞内微管、微丝等细胞骨架结构,同时可能需要Rho-GTPases成员的参与。(六)鉴于pDHY内化PC-3细胞的效率较高,我们考察了 pDHY携带凋亡相关的蛋白、质粒DNA以及RNAoligo进入PC-3细胞的效率和生物活性。流式细胞实验结果显示,经His-pDHY-Vp3处理48h后,PC-3细胞的凋亡率出现上升,与正常组相比差异具有统计学意义(P=0.009),同时与单纯使用His-Vp3处理组相比差异也具有统计学意义(P=0.014)。上述结果提示,融合蛋白pDHY-Vp3可以有效诱导PC-3细胞发生凋亡,其效果明显优于Vp3的单独作用。该数据运用SPSS 13.0软件进行统计学分析,采用One-way ANOVA方差分析。Q-PCR、Western-blot以及台盼蓝实验结果显示,当pDHY与质粒DNA以及RNA oligo以合适的比例(pDHY:MiR-200b mimics为 10:1,pDHY:pcDNA3-TP73为50:1)形成非共价键复合物时,其转导的效率与转染试剂Lipofect 2000相当,差异不具有统计学意义(P=1.000和P=0.378),然而对细胞的毒性却明显低于转染试剂Lipofect 2000,差异具有统计学意义(P<0.001)。同时,当Lipofect 2000的转染体系中按照比例加入了pDHY之后对Lipofect 2000转染效率有明显提高,差异具有统计学意义(P=0.005和P=0.041),而细胞毒性作用却与Lipofect 2000单独作用时相当,差异不具有统计学意义(P=1.000)。该数据运用SPSS 13.0软件进行统计学分析,采用One-way ANOVA方差分析。CCK-8实验结果显示,当PC-3细胞中过表达MiR-200b和TP73时,细胞的增殖率明显下降,差异具有统计学意义(P<0.001)。伴随pDHY的加入和转染效率的提高,PC-3细胞中MiR-200b和TP73表达量水平较Lipofect 2000单独使用时更高,而与此同时PC-3细胞增殖率的下降趋势也更加显著,与Lipofect 2000单独使用组之间差异具有统计学意义(P<0.001)。以上结果也验证了MiR-200b和TP73表达量的下调与AIPC细胞增殖呈现相关性的结论。该该数据运用SPSS 13.0软件进行统计学分析,采用One-way ANOVA方差分析。综上所述,针对目前CPPs研究中存在的不足和困难,借鉴功能蛋白质组学研究的手段和策略,本论文首先利用噬菌体展示随机肽库建立起了一个高通量、系统地寻找CPPs和高效、简便验证其穿膜能力的方法。接着,利用生物信息学的手段完成了对文库CPPs中153条序列的整理,总结了序列的理化特征,并获取了信息中的特征基序。上述工作的意义在于从组学研究的视角,对CPPs的规律性进行研究,为CPPs的结构改造以及预测提供有力的指导。另一方面,本论文以文库中丰度最高序列特殊的pDHY进行了关于动力学、细胞毒性、细胞特异性、代谢稳定性、内化机制以及生物学功能的系统研究,探索了pDHY在前列腺癌研究和治疗中的应用。由于受到实验手段和知识水平的局限,我们对以pDHY为代表的CPPs研究仍有待于进一步深入,但是该项工作对于拓宽和补充现有对CPPs的认识,扩充和完善对细胞膜物质转运机制的理解具有重要的理论价值,同时该工作对于CPPs在细胞生物学、药物开发、基因生物治疗以及肿瘤靶向治疗等研究领域等的应用,具有重要的实践意义。