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目的:明确褪黑素在内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)条件下通过抑制环氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)对Hep G2肝癌细胞凋亡水平的影响,及其分子机制进行初步探讨。方法:通过免疫组化法检测COX-2、活化转录因子6(activating transcription factor6,ATF-6)、肌醇需求激酶1(inositol-requiring enzyme 1,IRE-1)、双链RNA激活的蛋白激酶样内质网激酶(protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)在肝癌组织中的表达并分析未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)信号通路与COX-2表达的相关性。用Western blot检测不同浓度褪黑素对Hep G2肝癌细胞中三条UPR通路蛋白表达变化情况,使用小干扰RNA(Small interfering RNA,si RNA)分别干扰UPR三条通路的表达,使用Western blot技术检测COX-2蛋白以及RT-q-PCR法检测COX-2 m RNA的表达,从而了解UPR通路与COX-2表达的相关性。Western blot法检测COX-2、CCAAT/增强子结合蛋白的同源蛋白(C/EBP homologous protein 10,CHOP)、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)以及Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2-associaed X protein,Bax)表达的变化,进而了解褪黑素对Hep G2肝癌细胞凋亡的影响。TUNEL法、Annexin V+PI双染流式细胞术观察褪黑素转染ATF-6 si RNA对Hep G2肝癌细胞凋亡的相关机制。结果:1.肝癌组织中UPR信号通路与COX-2的相关性:采用免疫组化法检测COX2、ATF-6、IRE-1、PERK的表达并分析其相关性,结果显示:100例肝癌患者中,研究发现COX-2阳性组,ATF-6的阳性率为87%,IRE-1的阳性率为60%,PERK的阳性率为60%,COX-2阴性组中ATF-6的阴性率为29%,IRE-1的阴性率为55%,PERK为53%。相关性分析显示,COX-2和ATF-6的表达呈正相关(P=0.011),与IRE-1(P=0.086)及PERK(P=0.134)无相关性。2.不同浓度褪黑素对Hep G-2肝癌细胞UPR信号通路的影响:浓度为3μmol/L的衣霉素预处理Hep G-2肝癌细胞8小时后,预计设4个褪黑素浓度组(10-9、10-7、10-5、10-3mmol/L),以不加褪黑素为空白对照。褪黑素作用于Hep G-2肝癌细胞24小时,使用Western blot检测三条UPR通路蛋白表达变化,最后结果证明10-5mmol/L及10-3mmol/L浓度的褪黑素可有效抑制ATF-6、IRE-1及PERK三条UPR通路的表达,有统计学意义,其中10-5mmol/L考虑系褪黑素药理浓度,故选用该浓度作为后续处理细胞的浓度。3.Western blot检测si RNA干扰效率:分别将PERK、IRE-1和ATF-6通路中的三条si RNA同源序列转染Hep G-2中,24小时后提取肝癌细胞总蛋白,分别检测各组同源序列阻断后PERK、IRE-1和ATF-6蛋白的表达情况。结果显示:si-PERK和si-IRE-1各有两条同源序列明显抑制PERK和IRE-1的表达,si-ATF6-1的抑制作用最明显;后期实验选择抑制作用较强si-PERK-3和si-IRE1-3进行特异性阻断UPR通路。4.内质网应激后Hep G2肝癌细胞UPR通路与COX-2表达的相关性:为了解三个UPR通路与COX-2表达的相关性,使用浓度为3μmol/L的衣霉素预处理Hep G2肝癌细胞8小时,分别转染ATF-6、IRE-1及PERK三条通路的si-RNA进行干扰,24小时后提取各组COX-2蛋白进行Western blot检测和定量RT-PCR检测m RNA含量,结果均显示,TM组COX-2表达较空白对照组明显增加,而si-ATF-6组COX-2表达较TM组明显降低,有统计学意义(P<0.01),而si-IRE-1及si-PERK表达无明显变化。5.转染ATF-6 si RNA对内质网应激后Hep G-2肝癌细胞的影响;3μmol/L衣霉素预处理Hep G-2肝癌细胞用8小时后转染ATF-6 si RNA作用24小时,使用Annexin V-PI双染流式细胞术及TUNEL法技术观察Hep G-2肝癌细胞凋亡情况。结果均显示ATF-6 si RNA转染组与空白对照组和只加衣霉素诱导内质网应激组相比,凋亡比例均明显增加,有统计学意义(P<0.01)。6.褪黑素诱导内质网应激后HepG2肝癌细胞凋亡的通路:3μmol/L衣霉素预处理Hep G2肝癌细胞8小时后,分别加入10-5mmol/L浓度的褪黑素作用24小时或转染ATF-6 si RNA作用6小时,设置空白对照组、单独衣霉素组、加褪黑素组、及加ATF-6 si RNA转染组,Western blot检测四组中COX-2和CHOP、Bcl-2及Bax凋亡相关蛋白水平变化。结果显示,在内质网应激后的Hep G2肝癌细胞中,加褪黑素组和加ATF-6 si RNA转染组CHOP、Bax表达均显著上升,Bcl-2的表达下降,Bcl-2/Bax比值显著降低,有统计学差异(P<0.01)。7.比较褪黑素和转染ATF-6 si RNA对内质网应激后Hep G-2肝癌细胞凋亡的影响:3μmol/L衣霉素预处理Hep G2肝癌细胞8小时后,分别加入10-5mmol/L浓度的褪黑素作用24小时或转染ATF-6 si RNA作用6小时,设置空白对照组、单独衣霉素组、加褪黑素组、及加ATF-6 si RNA转染组,使用Annexin V-PI双染流式细胞术及TUNEL法观察四组Hep G-2肝癌细胞凋亡情况。与空白对照组相比,内质网应激后可轻度诱导肿瘤细胞凋亡(P<0.05)。而加褪黑素组和加ATF-6 si RNA转染组,与单独衣霉素组比较,细胞凋亡率均显著增加(P<0.01)。结论:1.COX-2和ATF-6的表达呈正相关,抑制ATF-6可以抑制COX-2的表达,从而表明过表达的COX-2可能与ATF-6通路的激活相关。2.抑制ATF-6可增加细胞凋亡,ATF-6可能参与了内质网应激后Hep G2肝癌细胞的凋亡抵抗。3.褪黑素可能通过抑制ATF-6通路下调COX-2表达,进而增加Hep G2肝癌细胞凋亡。