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家蚕是鳞翅目昆虫的典型代表，作为第二大模式昆虫，它不仅有着重要的研究价值，而且可以带来可观的经济价值。转基因技术的成功建立是生命科学领域的里程碑，它频繁的被用于改变生物的性状以及通过这种技术在生物体中表达一些珍贵的外源蛋白。PiggyBac转座子是最具吸引力的转座原件之一，它已经广泛的被应用于十多种生物的研究。PiggyBac转座子介导的转基因技术为家蚕的转基因研究提供了坚实的基础。家蚕丝腺有着惊人的蛋白合成和分泌的能力，是一种非常理想的生物反应器。经过数十年的努力，研究人员已经创建了家蚕中部和后部丝腺生物反应器。这些生物反应器已经成功表达了数十种外源蛋白。然而，现有的家蚕丝腺生物反应器效率依旧不高，主要体现在piggyBac转座子介导的转基因效率低、外源蛋白表达量较低、以及理想的转基因阳性个体筛选较复杂等等，这几个问题成为了建立高效家蚕丝腺生物反应器所面临的最大障碍。因此，提高转基因效率、提高外源基因表达量以及创建一种快速外源基因高效表达的转基因阳性个体筛选方法显得尤为重要。本文就针对这些科学问题展开了一系列的研究，取得的主要成果归纳如下: 1、类转录激活因子效应蛋白介导piggyBac转麈子的商效转座 针对piggyBac介导的转基因效率不高这个问题，本研究创建了一种有效提高转座效率的新方法，该方法的核心是构建一个类转录激活因子效应蛋白（transcription activator-like effector，TALE）和piggyBac转座酶（PBase）的融合蛋白（TALE-PBase）。实验证明TALE-PBase融合蛋白可以显著地将转座效率提高到63.9％，这相当于是目前转座效率平均水平的7倍。而且新方法的转基因阳性蛾区中的阳性个体数每区平均达到近18条，比目前家蚕转基因实验的平均水平最大提高了5.7倍。TALE-PBase融合蛋白介导的转基因技术不仅提高了转基因阳性蛾区数，而且也明显提高了阳性蛾区中的阳性个体数。这两方面的提高是piggyBac转座子介导的转基因技术的巨大突破，为今后的转基因研究提供了很好的技术支撑。 2、家蚕丝胶1启动子的结构与活性分析 启动子是调控目的基因时空表达重要的调控原件之一。然而，绝大多数的研究将目光放在了核心启动子或近端启动子区域，而近端启动子5端的序列常常被人们所忽视。本研究就4kb长度的家蚕丝胶1（sericin1，Ser1）启动子序列通过生物信息学方法预测到种类众多的潜在的转录因子结合位点，采用转基因实验发现启动子序列包含的转录因子结合位点越多且种类越丰富时，启动子的转录活性就越强大。但是重复的近端启动子多个拷贝组合并不能提高下游基因的转录水平，而且重复的近端启动子拷贝数越多，下游基因的转录水平反而越低。结果说明，4kb长度的Ser1启动子要比其短的启动子活性要高，重复的近端启动子多个拷贝组合并不能提高下游基因转录活性。这个结果为今后构建高效家蚕丝腺生物反应器时选择合适长度的启动子提供了参考。 3、PiggyBac转座子在家蚕基因中的定向转座 转座子的随机转座时常不利于外源基因的表达，而且可能会引起内源基因的突变。TALE-PBase融合蛋白介导的转座理论上有可能实现定向转座。PBase通过TALE靶向蛋白的牵引到达目的位点，从而在目的位点实现定向转座。通过研究我们发现了TALE-PBase介导的转座改变了piggyBac转座子原先完全随机插入的特性，而是变的更加具有倾向性，但还没有得到真正定向转座的结果。我们还在71个转座家蚕中发现了2对插入位点一样的家蚕，这种现象在常规的piggyBac转座研究中是非常罕见的。由此可见，TALE对PBase在一定程度上起到了靶向引导作用，这为今后在个体水平实现定点转座提供了宝贵的参考价值。 4、TALEN介导的家蚕同源重组 家蚕受精卵相当于家蚕的早期个体，相比细胞，它更能反应生命的真实情况。因此，用家蚕受精卵进行同源重组(homologous recombination，HR)实验可以反应个体水平同源重组的发生概率。同源重组精确的基因组编辑能力可以弥补其它基因组打靶技术的不足，而且也可以解决piggyBac转座子随机插入基因组这一问题。但同源重组的低效率现象是阻碍其广泛应用的一个限制因素。本研究采用蚕卵为材料，将TALEN mRNA和供体同源重组质粒注射到产卵8h的家蚕受精卵内，经72 h后进行TALEN打靶效率的鉴定以及同源重组效率的检测，结果发现TALEN在显微注射后72h就已经对靶位点产生了明显突变，在检测的15组样品中有12组出现了明显打靶，打靶效率达到80％。并且在15组受精卵中成功检测到3组包含阳性的同源重组个体，同源重组效率达到20％。这种蚕卵早期的TALEN打靶效率以及同源重组效率的检测可以在短期内评判实验的可行性，为后续阳性同源重组个体的筛选提供保障。同时也证明采用TALEN mRNA和供体同源重组质粒组合可以实现精确的基因组编辑。 5、外源基因表达效率的辅助检测 虽然piggyBac转座子是以随机的方式插入基因组，但是将外源基因表达框和标志基因表达框以相同转录方向紧密的构建在一起时，我们相信印使在不同的插入位点，两个表达框受到来自基因组的影响是相近的。我们构建了萤火虫荧光素酶（firefly luciferase，FLuc）和绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，EGFP）两个相邻的基因，作了转录水平的相关分析，结果表明即使插入位点不同，这两个基因的转录水平总是显著相关的。ELISA实验进一步显示EGFP的转录水平和翻译水平同样也是显著相关。所以，外源基因的表达水平可以通过检测标志基因(EGFP)的表达水平来简单的预测。 综上所述，本论文从提高转基因效率、提高外源基因的表达效率以及建立外源基因表达效率的辅助检测方法这3个层次来优化家蚕丝腺生物反应器并取得了相应的成果，为最终建立高效家蚕丝腺生物反应器奠定了坚实的基础。