低温、手术创伤对大鼠空间学习记忆能力的影响前言Tau蛋白是一种具有生理功能的可溶性蛋白,能够与微管蛋白结合,在神经元及轴突的生长过程中起着重要作用。二十世纪80年代最早有报道描述了tau蛋白,后来不断发现tau蛋白还有高度磷酸化和神经纤维缠结(neurofibrillary tangles (NFTs))的形式存在。在以后20年里,NFT被认为是神经退行性变的病理基础。但是,许多研究中发现,NFT形成之前的高度磷酸化tau蛋白的聚集同样导致记忆紊乱,利用转基因鼠的研究也提示,其空间记忆的损害与tau病理有关。全身麻醉药能够明显地损害正常的体温调节,导致围手术期低温。有关围手术期低温引起的生化改变,以及对tau病理和学习记忆的影响却知之甚少。已有研究报道了麻醉对鼠脑tau蛋白磷酸化的影响,发现并非麻醉本身,而是继发于麻醉的低温抑制了磷酸酶活性,从而导致tau蛋白磷酸化。近些年,术后认知功能障碍逐渐成为研究热点,但是,对于体内有关炎性反应影响tau病理,从而引发学习记忆改变的研究并不多见。关于炎性因子对啮齿类认知功能的影响的研究提示,对于老年鼠,小手术即可以引发夸大的神经炎性反应,但并不损害其Morris水迷宫的测试能力,另一研究提示,手术引发了大鼠短暂的认知下降,并且伴随有短暂的海马内胶质细胞的激活和促炎性因子的释放。糖原合酶-3β(glycogen synthase kinase-3beta, GSK-3β)是AD大脑中神经纤维缠结形成之前的一个重要的磷酸化tau蛋白的激酶。GSK-3p能够促进小胶质细胞对炎症的反应,而利用其抑制剂可以局限这种反应。在人类包涵体肌炎的细胞中,利用氯化锂抑制GSK-3p的活性可以减轻tau蛋白的磷酸化,GSK-3p和tau蛋白的共同定位,进一步说明GSK-3β在tau病理中的作用。因此,我们探究了手术创伤引发的免疫反应是否增加神经炎性反应和认知损害,而且,我们更关注于炎性因子是否通过GSK-3β介导tau病理。虽然低温可能对危重病人有利,但是围手术期由麻醉带来的低温对大多数病人是有害的。低温虽然没有引起明显的神经损害,但是可能带来认知功能障碍。本研究旨在利用Y-迷宫对大鼠工作记忆和参考记忆进行测试,探讨暴露于临床相关浓度的异氟烷是否导致tau蛋白高度磷酸化以及是否带来记忆损害。同时,我们测试了给与或不给予氯化锂处理的脾切除鼠的空间记忆能力,试图揭示围手术期低温以及炎性因子对术后认知功能的影响机制。材料和方法雄性成年SD大鼠购于中国医科大学动物实验中心,6月龄,体重350-400g，动物在22-23℃环境中自由活动,12：12小时日夜循环,自由进食水。大鼠吸入异氟烷麻醉诱导后气管插管,机械通气维持异氟烷浓度为1.3%-1.5%,期间监测大鼠心电图及直肠温。实验一：大鼠随机分为三组：健康对照组(group A; n=15)无任何干预措施。麻醉保温组(group B; n=60),大鼠异氟烷麻醉后利用加温垫保持体温在36.0-37.0℃。麻醉低温组(group C; n=60),大鼠麻醉后暴露于22℃室温。麻醉后大鼠自然苏醒分笼饲养。B,C组大鼠分别于2h麻醉后即刻,麻醉后1,3,7天(15只／时点)处死,标记为B0,B1,B3,B7,C0,C1,C3,和C7。实验二：大鼠随机分为三组：健康对照组(group A; n=15)无任何干预措施。手术保温组(group B; n=45),大鼠异氟烷麻醉后利用加温垫保持体温在36.0-37.0℃,行脾切除。手术低温组(group C; n=45),大鼠麻醉后暴露于22℃室温行脾切除。B,C,组所有动物均麻醉2小时,B,C组手术后1,3,7天处死(15只／时点)。B,C组动物每个时点标记为B1,B3,B7,C1,C3和C7。实验三：大鼠随机分为三组：健康对照组(group A; n=15)无任何干预措施。手术和氯化钠组(group C; n=45),异氟烷麻醉后脾切除,腹腔注射氯化钠。手术和氯化锂组(group D; n=45),异氟烷麻醉后脾切除,腹腔注射氯化锂。B,C组所有动物均麻醉2小时,期间保持体温36-37℃,B,D组手术后1,3,7天处死(15只／时点)。B,C组动物每个时点标记为B1,B3,B7,C1,C3和C7。利用Y-迷宫电刺激仪测试大鼠空间学习和记忆能力。免疫组织化学方法定位磷酸化tau蛋白,total tau蛋白以及GSK-3p表达。蛋白印迹分析方法检测磷酸化tau蛋白,total tau蛋白,IL-1β蛋白,TNF-a蛋白以及GSK-3p表达变化。利用丝氨酸-苏氨酸磷酸酶测定系统进行蛋白磷酸酶2A(PP2A)活性测定。实时定量PCR分析IL-1βmRNA和TNF-amRNA变化。实验数据统计为均数±标准差。利用SPSS13.0软件分析,同组间参数分析利用t检验,不同组间参数比较利用单因素或多因素方差分析,后继Dunnett检验,P<0.05认为有显著性差异。结果实验一：异氟烷麻醉后2h诱发低体温,大鼠直肠温度可以最低下降到26.0℃。麻醉期间的低温诱发麻醉后1天工作记忆的短暂损害。室温下暴露于异氟烷诱发大鼠脑内tau蛋白磷酸化,Thr205位点和Ser396位点与对照组比较分别增加了10倍和2.9倍,但total tau没有显著变化。高度磷酸化Thr-205和total tau抗体双染表达定位于海马CA1区。当麻醉鼠进行保温处理时,磷酸化位点恢复到对照组水平。麻醉诱发的低温抑制大鼠脑内PP2A活性下降45%,保温后活性恢复。实验二：麻醉后低温接受手术大鼠,术后1,3天工作记忆短暂损害。麻醉后保温接受手术大鼠,术后3天工作记忆短暂损害。手术后3天大鼠脑内tau蛋白Thr205位点和Ser396位点磷酸化与对照组比较分别增加了2.7倍和1.1倍,但totaltau没有显著变化。高度磷酸化Thr-205和GSK-3β抗体双染表达定位于海马CA1区。与对照组比较,术后第1,3天手术保温组IL-1pmRNA分别增加1.6倍和60%,手术低温组增加17.3倍和1.6倍。术后1天手术保温组和低温组TNF-amRNA的表达分别增加0.32和1倍,第3天低温组TNF-amRNA的表达增加0.6倍。术后1天,保温组和低温组IL-1β蛋白表达分别增加0.73和1.35倍。TNF-a蛋白表达没有显著变化。在手术组大鼠,GSK-3β激活,表现为无活性状态的磷酸化GSK-3p的保温组和低温组分别降低55%和53%,而GSK-3β总体水平没有变化。实验三：手术后接受氯化钠处理的大鼠,术后3天测试工作记忆短暂损害。手术后接受氯化锂处理的大鼠,术后工作记忆与对照组没有明显差异。手术创伤使氯化钠组大鼠术后3天脑内tau蛋白Thr205位点和Ser396位点磷酸化与对照组比较分别增加了2.7倍和1.2倍,但total tau没有显著变化。给与氯化锂干预后tau蛋白与对照组没有明显变化。高度磷酸化Thr-205和GSK-3β抗体双染表达定位于海马CA1区。与对照组比较,术后第1,3天氯化钠组IL-1βmRNA分别增加1.5和0.5倍,氯化锂组增加1.4倍和50%(P<0.01)。术后1天,氯化钠组和氯化锂组IL-1β蛋白表达分别增加0.9和0.67倍。术后第1天两组TNF-αmRNA的表达均增加0.23倍。TNF-α蛋白表达没有显著变化。在氯化钠组,GSK-3β激活,表现为无活性状态的磷酸化GSK-3β降低55%,而GSK-3β总体水平没有变化。氯化锂组磷酸化GSK-3β与对照组没有显著差异。结论1、异氟烷麻醉后可以导致持久的低温,tau蛋白磷酸化并非麻醉本身所致,而是麻醉诱发的低温对磷酸酶活性的抑制,从而引起tau蛋白磷酸化。麻醉后低体温引起大鼠空间学习记忆能力的损害是磷酸化tau蛋白作用的结果。2、大鼠脾切除术后第3天tau蛋白磷酸化是手术创伤的结果,手术创伤引起的炎性反应激活蛋白激酶,从而诱发tau蛋白磷酸化。大鼠脾切除后表现出的学习记忆的损害是磷酸化tau作用的结果。3、手术创伤可以激活GSK-3β,诱发tau蛋白高度磷酸化。利用氯化锂抑制GSK-3β的活性,可以使高度磷酸化的tau蛋白恢复到正常水平。