内毒素是指革兰氏阴性细菌细胞壁的主要活性成分脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)。当病灶或血流中革兰氏阴性细菌死亡,释放出LPS入血,形成内毒素血症(endotoxemia,ETM)。在此过程中,LPS可诱导炎性细胞产生多种促炎细胞因子如肿瘤坏死因子-a (tumor necrosis factor-a,TNF-a)、白细胞介素-1β(interleukin,IL-1β)、白细胞介素-6(interleukin,IL-6)等,这些细胞因子可再度激活炎症细胞,释放更多的促炎因子,导致全身性炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)。肺脏是内毒素血症时最易受损的靶器官之一,主要表现为急性肺损伤(acute lung injury, ALI),病理变化以肺间质水肿、毛细血管淤血和肺泡间隔增厚为主,成为内毒素血症死亡的主要原因。如果短时间内大量LPS入血或血液中LPS不被及时清除, ETM则会引起微循环障碍,最终形成内毒素休克(endotoxin shock,ES)。体循环和肺循环血流动力学紊乱是形成ES时主要的血流动力学变化。在此过程中,体循环血流动力学紊乱主要表现为平均动脉压(mean artery pressure , MAP)进行性下降,重要器官如肝、肾等血流灌注不足;肺循环血流动力学紊乱主要表现为肺动脉压(pulmonary artery pressure,PAP)早期升高晚期下降,上述血流动力学紊乱可最终形成多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)。内毒素血症为临床的危重病症,死亡率极高,目前人类尚未找到有效的治疗的方法,因此探寻抗ETM生物学药物成为该领域亟待解决的问题。胆囊收缩素(cholecystokinin, CCK)是一种脑肠肽,广泛分布于体内神经、消化、呼吸、免疫系统等多个系统,参与多种生理和病理过程的调节。CCK在生物体内有多种存在形式,其中硫酸化的羧基端八肽,又称八肽胆囊收缩素(cholecystokinin octapeptide,CCK-8),是具有CCK完全功能的最小活性片段。多年来,我室一直致力于CCK-8抗LPS作用的研究,CCK-8预处理一方面可减轻LPS诱导的肺脏间质水肿及毛细血管淤血等炎性病理损伤;另一方面可改善LPS诱导的血流动力学障碍,延缓MAP下降和PAP升高,提示CCK-8对ETM有预防作用。那么在LPS入血后,给予CCK-8是否仍然能对抗LPS引起上述损伤,即CCK-8对ETM是否具有治疗作用,目前尚未见报道。因此,本实验将采用静脉注射不同剂量LPS复制大鼠内毒素血症模型,在LPS入血之后给予CCK-8,从整体水平探讨CCK-8抗内毒素血症的作用,从而为临床治疗内毒素血症提供新的思路和治疗靶点。1 CCK-8对内毒素血症大鼠肺脏炎症反应的影响目的:观察CCK-8对低剂量LPS诱导内毒素血症大鼠肺组织促炎细胞因子TNF -α、IL-1β、IL-6生成和肺脏组织结构的影响方法:Sprague Dawley (SD)大鼠48只。实验分组:①control组在各时间点依次注入与实验组同体积的生理盐水;②醋酸铅组依次注入醋酸铅2.5mg/100g b.w.、生理盐水(与相应时间点等体积);③LPS组依次注入醋酸铅、LPS 1mg/kg、生理盐水(与相应时间点等体积);④LPS+CCK-8组依次注入醋酸铅、LPS、生理盐水(与相应时间点等体积)、CCK-8 20μg/kg(LPS后30min);⑤LPS+ CCK-1R阻滞剂+CCK-8组依次注入醋酸铅、LPS、CCK-1R阻滞剂0.5 mg/kg (LPS后20min)、CCK-8(LPS后30min);⑥LPS+ CCK-2R阻滞剂+CCK-8组依次注入醋酸铅、LPS、CCK-2R阻滞剂0.5 mg/kg (LPS后20min)、CCK-8(LPS后30min);⑦LPS+DMSO+PF+CCK-8组依次注入醋酸铅、LPS、DMSO+PF 0.1ml/100g b.w. (体积比1:4,LPS后20min)、CCK-8(LPS后30min);⑧CCK-8组依次注入醋酸铅、生理盐水(与相应时间点等体积)、CCK-8。均于LPS注入30min后开始计时,检测Control组和LPS组血液细菌内毒素含量,确定内毒素血症模型复制成功。检测各组大鼠肺组织中TNF -α、IL-1β、IL-6的含量,并用光镜和透射电镜分别观察各组大鼠肺脏组织结构变化。数据以x±s表示,单因素方差分析进行组间比较,有显著差异者用最小显著差法(least significant difference,LSD)进行两两比较,以P <0.05为有显著差异。实验结果如下:(1)LPS组的细菌内毒素的含量明显高于control组(2.39±0.20)EU·ml-1 vs (0.14±0.02)EU·ml-1(P <0.05),标志内毒素血症已经形成。(2)LPS组2h后肺脏TNF-α含量显著高于control组(1620.87±329.61)pgl·L-1 vs (663.00±155.56)pg·L-1(P<0.05)。给予CCK-8后TNF-α含量(1215.11±260.31)pg·L-1较LPS组显著减少(P<0.05)。预先应用CCK-2R阻滞剂后TNF-α含量升高(1678.56±394.87)pg·L-1,明显抑制了CCK-8的效应(P<0.05)。预先应用CCK-1R阻滞剂对CCK-8的效应无明显影响(P>0.05)。CCK受体阻滞剂的溶剂对照组(LPS+DMSO+PF+CCK-8组)的TNF-α含量与LPS+CCK-8组相比无明显差异(P>0.05)。醋酸铅和CCK-8组细胞因子含量较Control组无显著差异(P>0.05)。(3)LPS组2h后肺脏IL-1β含量显著高于control组(6189.17±791.40)pg·L-1 vs (508.84±85.08)pg·L-1(P<0.05)。给予CCK-8后IL-1β含量(5023.31±855.82)pg·L-1较LPS组显著减少(P<0.05)。预先应用CCK-2R阻滞剂后, IL-1β含量升高(5988.78±504.67)pg·L-1,明显抑制了CCK-8的效应(P<0.05)。预先应用CCK-1R阻滞剂对CCK-8的效应无明显影响(P>0.05)。CCK受体阻滞剂的溶剂对照组(LPS+DMSO+PF+ CCK-8组)的IL-1β含量与LPS+CCK-8组相比无明显差异(P>0.05)。醋酸铅和CCK-8组细胞因子含量较Control组无显著差异(P>0.05)。(4)LPS组12h后肺脏IL-6含量显著高于对照组(1641.29±198.21)pg·L-1 v(s124.64±24.30)pg·L-(1P<0.05)。给予CCK-8后IL-6含量(874.03±114.02)pg·L-1较LPS组显著减少(P<0.05)。预先应用CCK-2R阻滞剂后,IL-6含量升高(1433.00±180.28)pg·L-1,明显抑制了CCK-8的效应(P<0.05)。预先应用CCK-1R阻滞剂对CCK-8的效应无明显影响(P>0.05)。CCK受体阻滞剂的溶剂对照组(LPS+DMSO+PF+ CCK-8组)的IL-6含量与LPS+CCK-8组无明显差异(P>0.05)。醋酸铅和CCK-8组细胞因子含量较Control组无显著差异(P>0.05)。(5)LPS组大鼠12 h后肺小动脉充血,肺泡间隔增宽,毛细血管扩张淤血、PMN增加;肺泡腔萎陷较为明显。在注射LPS 30min后即内毒素血症形成后给予CCK-8可明显改善上述病变。预先给予CCK-2R阻滞剂可明显抑制CCK-8的效应,而预先给予CCK-1R阻滞剂则对CCK-8的效应无明显影响。CCK受体阻滞剂的溶剂对照组(LPS+DMSO+PF+CCK-8组)与LPS+CCK-8组相比,无明显变化。Contro组、醋酸铅组和CCK-8组大鼠肺组织结构清晰,无异常改变。(6)LPS组大鼠12 h后肺毛细血管内PMN增加,内皮细胞肿胀,胞质电子密度降低,饮泡增多。肺泡隔细胞板层体排空。Ⅱ型肺泡上皮细胞微绒毛减少,线粒体肿胀、空化,板层体减少。预先给予CCK-2R阻滞剂可明显抑制CCK-8的效应,,而预先给予CCK-1R阻滞剂则对CCK-8的效应无明显影响。CCK受体阻滞剂的溶剂对照组(LPS+DMSO+PF+CCK-8组)与LPS+CCK-8组相比,无明显变化。Control组、醋酸铅组和CCK-8组大鼠肺组织结构清晰,无异常改变。2 CCK-8对内毒素血症大鼠血流动力学的影响目的:观察CCK-8对高剂量LPS诱导内毒素血症大鼠4小时死亡率、MAP、PAP、心率(heart rate,HR)、潮气量(tidal volume,TV)、肝脏微循环血流和肾脏微循环血流的影响。方法:Sprague Dawley (SD)大鼠48只。实验分组:①control组在各时间点依次注入与实验组同体积的生理盐水;②醋酸铅组依次注入醋酸铅20mg/100g b.w.、生理盐水(与相应时间点等体积);③LPS组依次注入醋酸铅、LPS 30mg/kg、生理盐水(与相应时间点等体积);④LPS+CCK-8组依次注入醋酸铅、LPS、生理盐水(与相应时间点等体积)、CCK-8 50μg/kg(LPS后30min);⑤LPS+CCK-1R阻滞剂+CCK-8组依次注入醋酸铅、LPS、CCK-1R阻滞剂1mg/kg (LPS后20min)、CCK-8;⑥LPS+ CCK-2R阻滞剂+CCK-8组依次注入醋酸铅、LPS、CCK-2R阻滞剂1mg/kg(LPS后20min)、CCK-8;⑦LPS+DMSO+PF+CCK-8组依次注入醋酸铅、LPS、DMSO+PF 0.1ml/100g b.w. (体积比1:4,LPS后20min)、CCK-8;⑧CCK-8组依次注入醋酸铅、生理盐水(与相应时间点等体积)、CCK-8。左侧颈动脉插管监测MAP、右侧颈静脉插管至肺动脉监测PAP、连接心电导连监测HR、气管插管监测TV、激光多普勒血流仪分别监测肝、肾微循环血流,连接生理记录仪。由于SD大鼠具有个体差异性,在预实验中表现出对LPS和CCK反应的不完全一致性,主要体现在MAP和PAP随时间点变化的不同。因此我们根据上述变化的不同,将动物分为两群,并设计了两组时间点来记录MAP和PAP。于LPS注入30min后开始计时,一组时间点分别于0h、1.5h、3h记录各组大鼠MAP、PAP、HR、TV、肝脏组织血流,其中肾脏组织血流记录时间分别为0h、0.5h、1h、1.5h;另一组时间点分别于0h、2h、3h、4h、6h、8h记录各组大鼠MAP、PAP。数据以x±s表示,单因素方差分析进行组间比较,有显著差异者用最小显著差法(least significant difference,LSD)进行两两比较,以P <0.05为有显著差异。实验结果如下:(1)第一群大鼠4小时死亡率变化第一群大鼠LPS组的死亡率为100%,给予CCK-8后死亡率明显降低至0%,预先应用CCK-2R阻滞剂明显抑制了CCK-8的效应,而预先应用CCK-1R阻滞剂则对CCK-8的效应无明显影响。(2)MAP和PAP变化按照第一组时间点记录第一群大鼠MAP和PAP的变化,结果如下:control组1.5 h和3h,MAP分别为13.79±0.78 kPa,13.76±1.34 kPa; PAP分别为1.85±0.67 kPa,2.40±0.11 kPa。LPS组1.5 h,MAP下降至8.24±2.11 kPa,PAP升高为3.66±0.66 kPa(早期升高),与对照组1.5 h时间点相比有显著差异(P<0.05);注射LPS 3h, MAP进一步下降至4.81±0.81 kPa(P<0.05),而PAP却随着MAP的进行性降低由早期升高转为晚期下降,为2.63±0.48 kPa,与对照组相比无显著差异(P>0.05)。给予CCK-8可明显延缓LPS诱导的上述各时间点MAP的进行性下降,分别为11.09±1.91 kPa、8.47±1.22 kPa(P<0.05);预先应用CCK-2R阻滞剂使上述各时间点MAP分别降至8.36±2.02 kPa、4.00±0.84 kPa,明显抑制了CCK-8的效应(P<0.05);预先应用CCK-1R阻滞剂对CCK-8的效应无明显影响(P>0.05)。而CCK-8对LPS诱导的PAP的影响不同于对MAP的影响,给予CCK-8不能有效缓解LPS诱导的1.5h时间点PAP的升高(P>0.05),甚至表现为3h时间点PAP进一步升高;预先应用CCK-1R阻滞剂和CCK-2R阻滞剂对CCK-8的效应均无明显影响(P>0.05)。CCK受体阻滞剂的溶剂对照组(LPS+DMSO+PF+CCK-8组)的上述各时间点MAP、PAP分别与LPS +CCK-8组相比无明显差异(P>0.05);醋酸铅组和CCK-8组的MAP、PAP与control组比较也未见显著差异(P>0.05)。除醋酸铅组、CCK-8组与control组外,其余各组MAP、PAP在各时间点用药前后均发生明显改变(P<0.05-0.001),提示单独应用醋酸铅或CCK-8对第一群大鼠MAP、PAP的变化无明显影响。按照第二组时间点记录第二群大鼠MAP和PAP的变化,结果如下:control组2h、3h、4h、6h、8h,MAP分别为14.69±0.95 kPa、14.86±0.95 kPa、15.05±0.62 kPa、13.95±0.11 kPa、13.83±0.51 kPa;LPS组MAP呈现进行性下降的趋势,在相应时间点分别为:8.31±0.76 kPa、5.29±1.02 kPa、4.10±0.84 kPa、0.00±0.00 kPa(动物死亡)、0.00±0.00 kPa(P<0.05),与control组各时间点相比有显著差异(P<0.05),且与第一群大鼠相比,LPS诱导的第二群大鼠MAP下降速度更为缓慢。CCK-8对LPS诱导的MAP变化的影响与第一群动物相似,即CCK-8明显延缓了LPS诱导的上述各时间点MAP的进行性下降,于上述各时间点分别为:11.78±1.51kPa、11.73±1.71kPa、11.57±1.93kPa、9.92±0.58kPa、8.12±1.5kPa(P<0.05),且延缓MAP下降的程度较第一群动物更为明显;预先应用CCK-2R阻滞剂也同样明显抑制了CCK-8的效应(P<0.05),CCK-1R阻滞剂对CCK-8的效应无明显影响(P>0.05)。对于PAP ,control组在2h、3h、4h、6h、8h分别为2.39±0.43 kPa、2.20±0.17 kPa、2.32±0.21 kPa、1.97±0.18 kPa、2.26±0.25 kPa。给予LPS后上述各时间点,PAP分别为3.41±0.44 kPa、2.29±0.83 kPa、2.30±0.19 kPa、0.00±0.00 kPa、0.00±0.00 kPa(P<0.05),表现为早期升高晚期下降,变化趋势与第一群大鼠一致。但CCK-8对LPS诱导的PAP变化的影响与第一群动物不同,虽然给予CCK-8后PAP于2h时间点仍然表现为升高(3.72±0.25 kPa),与LPS组相比较无明显差异,P>0.05),但是在6h时PAP下降为2.66±0.51 kPa,而此时MAP为9.92±0.58 kPa,还未到达休克水平,提示CCK-8可在延缓MAP下降且未达休克水平时缓解LPS诱导的肺动脉高压。给予CCK-8后8h,PAP进一步下降至2.62±0.32 kPa,与control组相应时间点相比无显著差异,(P>0.05),而此时MAP为8.12±1.53 kPa,接近休克水平,进一步表明CCK-8缓解LPS诱导的PAH的效应可以维持到邻近休克水平。预先应用CCK-2R阻滞剂在6h、8h时间点可明显抑制CCK-8对LPS诱导的PAH的效应(P<0.05);而CCK-1R阻滞剂对CCK-8的效应无明显影响(P>0.05)。CCK受体阻滞剂的溶剂对照组(LPS+DMSO+PF+CCK-8组)的上述各时间点MAP、PAP分别与LPS+CCK-8组相比无明显差异;醋酸铅组和CCK-8组的MAP、PAP与control组比较也未见显著差异(P>0.05)。除醋酸铅组、CCK-8组与control组外,其余各组MAP、PAP在各时间点用药前后均发生明显改变(P<0.05-0.001),提示单独应用醋酸铅或CCK-8对第二群大鼠MAP、PAP的变化无明显影响。(3)HR变化处理前各组HR之间未见显著差异。control组1.5 h和3h HR分别为370±36 bpm、350±60bpm,LPS组相应时间点分别下降到229±34 bpm、196±50bpm,与control组比较有显著差异(P<0.05);给予CCK-8后上述各时间点HR分别升高为259±44 bpm、321±76 kPa,较LPS组显著升高(P<0.05)。预先应用CCK-2R阻滞剂上述各时间点HR降低至265±51 bpm、171±40 bpm(P<0.05),明显抑制了CCK-8的效应。预先应用CCK-1R阻滞剂对CCK-8的效应无明显影响(P>0.05)。CCK受体阻滞剂的溶剂对照组(LPS+DMSO+PF+CCK-8组)的上述各时间点HR分别为257±25 bpm、293±30 bpm与LPS +CCK-8组无明显差异(P>0.05)。醋酸铅组、CCK-8组与control组比较各时间点未见显著差异。除醋酸铅组、CCK-8组与control组外,其余各组HR在各时间点用药前后均发生明显改变(P<0.05-0.001),提示单独应用醋酸铅或CCK-8对HR的变化无明显影响。(4)TV变化处理前各组TV之间未见显著差异。LPS组1.5 h和3h分别下降到0.42±0.16 ml、0.26±0.14 ml,较control组相应时间点0.87±0.13 ml、0.90±0.17 ml显著降低(P<0.05);给予CCK-8后上述各时间点TV分别为0.73±0.22 ml、0.82±0.28 ml,较LPS组显著升高(P<0.05)。预先应用CCK-2R阻滞剂上述各时间点HR降低至0.30±0.18 ml、0.19±0.10 ml(P<0.05),明显抑制了CCK-8的效应。预先应用CCK-1R阻滞剂对CCK-8的效应无明显影响,(P>0.05)。CCK-8受体阻滞剂的溶剂对照组(LPS+DMSO+PF+CCK-8组)的上述各时间点TV与LPS +CCK-8组无明显差异(P>0.05)。醋酸铅组、CCK-8组与control组比较各时间点未见显著差异。仅LPS组和LPS+CCK-2R阻滞剂+CCK-8组的TV在各时间点用药前后发生明显变化(P>0.05),提示单独应用醋酸铅或CCK-8对TV的变化无明显影响。(5)肝微循环血流变化处理前各组肝微循环血流之间未见显著差异。LPS组1.5 h和3h分别下降到602.18±295.86 BPU、208.90±33.57 BPU,较control组1136.15±105.15 BPU、961.73±285.80 BPU在各时间点显著降低(P<0.05);给予CCK-8后上述各时间点肝微循环血流分别为748.65±289.41 BPU、927.91±225.03 BPU,较LPS组显著升高(P<0.05)。预先应用CCK-2R阻滞剂后,上述各时间点肝微循环血流明显降低至812.15±75.39 BPU、244.00±172.17 BPU(P<0.05),明显抑制了CCK-8的效应。预先应用CCK-1R阻滞剂对CCK-8的效应无明显影响(P>0.05)。CCK受体阻滞剂的溶剂对照组LPS+DMSO+PF+CCK-8组的上述各时间点肝微循环血流与LPS +CCK-8组无明显差异(P>0.05)。醋酸铅组、CCK-8组与control组比较各时间点未见显著差异。仅LPS组和LPS+CCK-2R阻滞剂+CCK-8组的肝微循环血流在各时间点用药前后发生明显变化(P>0.05),提示单独应用醋酸铅或CCK-8对肝微循环血流的变化无明显影响。(6)肾微循环血流变化处理前各组肾微循环血流之间未见显著差异。LPS组0.5h、1h和1.5h分别下降到20.13±1.71 BPU、3.09±0.62 BPU、1.78±0.79 BPU,较control组显著降低(P<0.05);给予CCK-8后上述各时间点肾微循环血流较LPS组显著升高,分别恢复至198.76±13.53 BPU、97.80±13.55 BPU、90.97±12.79 BPU(P<0.05)。预先应用CCK-2R阻滞剂可明显抑制CCK-8的效应,上述各时间点肾微循环血流明显降低,与LPS组无差异(P>0.05)。预先应用CCK-1R阻滞剂对CCK-8的效应无明显影响(P>0.05)。CCK受体阻滞剂的溶剂对照组(LPS+DMSO+PF+CCK-8组)的上述各时间点肾微循环血流与LPS +CCK-8组无明显差异(P>0.05)。醋酸铅组、CCK-8组与control组比较各时间点未见显著差异。除醋酸铅组、CCK-8组与control组外,其余各组肾脏微循环血流在各时间点用药前后均发生明显改变(P<0.05-0.001),提示单独应用醋酸铅或CCK-8对肾微循环血流的变化无明显影响。结论1在内毒素血症形成后,应用CCK-8可抑制LPS诱导的大鼠肺脏促炎细胞因子生成,显著改善LPS诱导的肺组织结构损伤。2 CCK-8一方面可明显延缓LPS诱导的ETM大鼠MAP进行性下降、改善肝、肾微循环血流,恢复HR;另一方面可有效降低LPS诱导的ETM大鼠PAH,改善TV。