研究背景：胃癌是世界上常见的恶性肿瘤之一,在全球癌症总发病率中排第五位,在癌症死亡原因中排第三位,其中以中国的发病率最高。胃癌发病率在我国男性中排第二位,在女性中排第三位,虽然近年来我国胃癌的发病率有下降趋势,但是发病人数依然较多,2015年我国估计有67.91万人诊断出胃癌,有49.8万人死于胃癌。早期胃癌的治疗主要以手术为主,但是绝大多数胃癌往往到了晚期才被确诊,晚期胃癌只能采取放化疗、靶向药物等治疗方法,疗效往往不理想。晚期胃癌往往伴随广泛浸润或远处转移,因此研究胃癌转移机制有助于进一步理解晚期胃癌的恶性生物学行为及发现新的治疗新策略。肿瘤转移是指肿瘤细胞脱离原发病灶在体内播散,并在其他部位定植生长形成继发肿瘤病灶。上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)被认为是恶性肿瘤转移的起始步骤。在EMT中,非运功的、有极性的、细胞连接紧密的上皮来源肿瘤细胞,转化成为非极性的、运动的、侵袭性的间质性细胞。发生EMT的肿瘤细胞,其分子标志发生了显著的变化,例如,上皮细胞-细胞粘附分子E-钙黏蛋白表达下降,而间质细胞的一些表型的表达则会上调,如波形蛋白、纤连蛋白。另外,肿瘤细胞也可改造细胞外基质(extracellular matrix, ECM)促进侵袭和转移,其中各种基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)的分泌发挥了重要作用。肿瘤微环境在肿瘤发生、发展及转移中的重要作用近年来受到了高度的重视。神经是肿瘤微环境的重要组成部分,虽然已经有研究证实肿瘤可以沿神经生长,然后通过神经途径播散,即嗜神经侵袭(perineural invasion, PNI),但是神经在肿瘤发生发展中所发挥的主动性作用却很少受到关注。早在19世纪40年代,就已经有研究探索了去除肿瘤神经支配所带来的效果,但是并未引起研究者重视神经对肿瘤的作用。2013年,Magnon等人发表的研究使研究者们重新关注到神经对于肿瘤的作用。他们揭示了自主神经系统对小鼠前列腺癌发生发展至关重要,其中,去除交感神经系统(sympathetic nervous system, SNS)主要在肿瘤发生的早期抑制生长,而去除副交感神经系统(parasympathetic nervous system, PNS)主要在肿瘤发展的后期抑制转移。2014年Zhao等人发表的另一篇文献报道,在小鼠胃癌模型中,手术或药物去除胃神经支配(即迷走神经切断术或局部注射神经毒性药物)能显著降低胃癌发生概率及胃癌进展速度。迷走神经末梢可以合成和释放乙酰胆碱,乙酰胆碱及其M3型胆碱受体已被报道参与了肺癌、肝癌、结肠癌及前列腺癌等的生长与转移,但是其对胃癌转移的作用及机制尚不明确。结肠转移相关基因-1(metastasis-associated in colon cancer-1, MACC1)是2008年在结肠癌中首先发现的一个促癌基因。Stein等人发现MACC1在肠结癌组织中的表达要高于正常结肠粘膜上皮,且是结肠癌病人的一个独立预后因素。2013年我们实验团队证实了MACC1在胃癌组织中高表达并与胃癌病人分期及预后相关。MACC1促进肝细胞生长因子受体c-Met信号并诱导胃癌细胞EMT、促进MMP2及MMP9的表达,从而促进胃癌生长、侵袭及转移。并且在糖剥夺情况下,胃癌细胞可通过磷酸化的腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)上调MACC1, MAAC1通过瓦伯格效应抵抗胃癌细胞代谢应激所带来的损伤,从而保持胃癌细胞的存活。我们通过生物信息学的方法发现胃癌中磷酸化的AMPK水平与M3型胆碱受体的编码基因CHRM3 (M3型胆碱受体的编码基因)的表达呈正相关。我们推测,乙酰胆碱作用于M3型胆碱受体后,可能通过磷酸化的AMPK促进MACC1的表达,并且MACC1在乙酰胆碱促胃癌转移过程中发挥了介导作用。因此本研究旨在探索乙酰胆碱对人胃癌细胞侵袭／迁移及EMT的影响,阐明M3型胆碱受体/AMPK/MACC1信号通路及其在人胃癌细胞侵袭／迁移及EMT中的作用。研究假设：1.乙酰胆碱促进人胃癌细胞侵袭／迁移及EMT；2.M3型胆碱受体介导乙酰胆碱促人胃癌细胞侵袭／迁移及EMT的作用；3.乙酰胆碱作用于M3型胆碱受体后,通过AMPK上调MACC1的表达,且MACC1在乙酰胆碱促人胃癌细胞侵袭／迁移及EMT中发挥重要的中间信号作用。研究内容：1.筛选M3型胆碱受体高表达的胃癌细胞株分别提取BGC-803、BGC-823、MGC-803、MKN-28、MKN-45、SGC-7901人胃癌细胞的RNA,逆转录成cDNA后,实时定量PCR检测各细胞株M3型胆碱受体的mRNA表达情况,并选取表达量最高的两株细胞进行后续实验。2.乙酰胆碱对胃癌细胞侵袭／迁移及EMT的影响将10uM浓度的乙酰胆碱添加到MKN-45及MGC-803胃癌细胞的培养基,分别培养0h、24h及48 h,用带有基质胶的Transwell侵袭实验及不带基质胶的Transwell迁移实验分别检测两株细胞的侵袭及迁移能力；同样再以10uM浓度的乙酰胆碱刺激MKN-45及MGC-803细胞0 h、24 h及48 h,各提取全部mRNA和蛋白质,将mRNA逆转录成cDNA,实时定量PCR检测EMT相关指标(E-钙黏蛋白、波形蛋白、纤连蛋白、MMP2及MMP9)的mRNA相对表达量,用Western blot的方法检测上述EMT指标的蛋白含量。我们也观察了乙酰胆碱刺激前后两株细胞的形态变化。3.M3型胆碱受体抑制剂对乙酰胆碱作用的影响在MKN-45及MGC-803胃癌细胞的培养基中加入M3型胆碱受体特异性抑制剂达非那新(10uM浓度),30 min后再加入10uM的乙酰胆碱,然后两株细胞培养48 h。实验一共分为四组：阴性对照、乙酰胆碱、达非那新、达非那新+乙酰胆碱。用带有基质胶的Transwell侵袭实验及不带基质胶的Transwell迁移实验分别检测两株细胞的侵袭及迁移能力。再按照上述分组培养MKN-45及MGC-803细胞株48 h,各提取两株细胞的mRNA和全蛋白,mRNA逆转录成cDNA后,实时定量PCR检测EMT相关指标(E-钙黏蛋白、波形蛋白、纤连蛋白、MMP2及MMP9)的mRNA相对表达量,用Western blot方法检测上述EMT指标的蛋白含量。4.乙酰胆碱的刺激对MACC1表达的影响生物信息学的方法分析M3型受体的编码基因CHRM3的表达情况与磷酸化AMPK的相关性。我们考虑MACC1可能为乙酰胆碱下游信号,将10uM浓度的乙酰胆碱添加到MKN-45及MGC-803胃癌细胞的培养基,分别培养0h、24h及48 h,各提取全部mRNA和蛋白质,将mRNA逆转录成cDNA,实时定量PCR检测MACC1的mRNA相对表达量,用Western blot的方法检测MACC1的蛋白含量。然后将MKN-45及MGC-803胃癌细胞按照阴性对照、乙酰胆碱、达非那新、达非那新+乙酰胆碱四组培养48 h后,实时定量PCR及Western blot分别检测MACC1的mRNA及蛋白含量。免疫荧光实验检测乙酰胆碱刺激后MACC1的核转位情况。5.MACC1在乙酰胆碱促胃癌细胞侵袭／迁移及EMT中的重要性将MKN-45及MGC-803细胞转染MACC1的沉默序列(siMACC1)或阴性对照序列(siCtrl),实时定量PCR及Western blot分别检测mRNA及蛋白水平的沉默效果。然后在转染有siMACC1或siCtrl的细胞中加入10uM乙酰胆碱进行培养,共分成四组：siCtrl、siMACC1、siCtrl+乙酰胆碱、siMACC1+乙酰胆碱。用带有基质胶的Transwell侵袭实验及不带基质胶的Transwell迁移实验分别检测两株细胞的侵袭及迁移能力。实时定量PCR及Western blot分别在mRNA及蛋白水平检测EMT相关指标(E-钙黏蛋白、波形蛋白、纤连蛋白、MMP2及MMP9)的变化。6.验证AMPK是乙酰胆碱/M3型胆碱受体与MACC1的中间信号将MKN-45及MGC-803胃癌细胞按照阴性对照、乙酰胆碱、达非那新、达非那新+乙酰胆碱四组培养48 h后,提取全蛋白,Western blot检测p-AMPK的蛋白含量。在两株细胞的培养基中加入8uM浓度的AMPK抑制剂Dorsomorphin,30 min后再加入10uM的乙酰胆碱,一共分为四组：阴性对照、乙酰胆碱、Dorsomorphin、达非那新+Dorsomorphin,培养48 h后,Western blot检测p-AMPK及MACC1的蛋白含量。7.统计方法所有的统计学分析都是用SPSS 20.0完成的,本文数据以平均值±标准误的形式表示,用one-way ANOVA的方法来分析组间的差异,双边的P值小于0.05被认为有统计学差异。研究结果：1.筛选M3型胆碱受体高表达的胃癌细胞株实时定量PCR检测各胃癌细胞株M3型胆碱受体的mRNA表达,发现MKN-45及MGC-803两株细胞CHRM3的mRNA表达最高,因此选择这两株细胞进行后续实验。2.乙酰胆碱刺激胃癌细胞侵袭／迁移并诱导EMT在Transwell侵袭及迁移实验中,在48 h内,乙酰胆碱逐渐增加了MKN-45及MGC-803胃癌细胞的侵袭及迁移数量,并且从实时定量PCR的结果可以看到,随着刺激时间增加,乙酰胆碱能逐渐降低两株细胞E-钙黏蛋白的mRNA表达,并增加了波形蛋白、纤连蛋白、MMP2及MMP9的mRNA表达。Western blot检测的蛋白水平也得到了与mRNA相同的趋势,说明48 h内乙酰胆碱逐渐诱导了胃癌细胞EMT。但是,乙酰胆碱的刺激未改变两株胃癌细胞的形态。3.M3型胆碱受体介导乙酰胆碱促胃癌侵袭／迁移及EMT在Transwell侵袭及迁移实验中,乙酰胆碱显著增加了MKN-45及MGC-803胃癌细胞的侵袭及迁移数量,而加入M3型胆碱受体抑制剂达非那新以后,乙酰胆碱对两株细胞的侵袭及迁移数量的改变均受到抑制。实时定量PCR及westernblot的结果显示,乙酰胆碱所诱导的E-钙黏蛋白表达下降,波形蛋白、纤连蛋白、MMP2及MMP9表达的上升,在达非那新存在的情况下都被逆转。并且,单独的达非那新也表现出抑制侵袭／迁移及EMT的能力。4.乙酰胆碱刺激MACC1表达上调通过对TCGA提取的胃腺癌相关数据分析得到,AMPK苏氨酸172位点磷酸化水平与CHRM3的mRNA表达呈正相关。结合我们实验室前期研究结论：磷酸化的AMPK可以上调MACC1,我们接下来验证了乙酰胆碱与MACC1的联系。我们发现,48 h内乙酰胆碱逐渐增加了MACC1的mRNA及蛋白表达,并且达非那新能逆转这一作用。但是乙酰胆碱对于MACC1的核转位没有明显改变。5.MACC1在乙酰胆碱促胃癌细胞侵袭／迁移及EMT中发挥了重要作用我们将MKN-45及MGC-803细胞转染了MACC1的沉默序列后,MACC1的mRNA及蛋白水平的表达都明显下降,说明沉默效果较好。MACC1的表达被沉默后,乙酰胆碱促胃癌细胞侵袭／迁移的作用都被抑制了。且不论从mRNA还是蛋白水平,乙酰胆碱降低E-钙黏蛋白,增加波形蛋白、纤连蛋白、MMP2及MMP9的作用也在沉默MACC1后逆转了。6.乙酰胆碱/M3型胆碱受体通过AMPK途径上调MACC1Western blot的结果显示,乙酰胆碱促进了p-AMPK的蛋白水平,并且这一作用可以被M3型胆碱受体抑制剂所逆转。另外,当使用Dorsomorphin抑制了AMPK活性后,乙酰胆碱促进MACC1表达的作用就被抑制了,说明AMPK是乙酰胆碱/M3型胆碱受体与MACC1的中间信号。研究结论：乙酰胆碱通过M3型胆碱受体/AMPK/MACC1信号通路促进了胃癌细胞侵袭／迁移并诱导了EMT。