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研究目的通过观察正常人、正虚型MDS患者及瘀毒型MDS患者外周血单个核细胞的自噬及ROS水平以及使用自制扶正解毒中药复方三子黄石散干预MDS细胞株SKM-1后对其自噬及ROS水平的影响,证明:①MDS患者与正常人以及不同证型MDS患者的自噬水平及有毒代谢产物ROS水平均存在差异;②使用含砷扶正解毒中药复方三子黄石散干预MDS细胞株SKM-1能通过增加其自噬量而减少有毒代谢产物ROS的堆积;③证明本文提出的假说:自噬是气化的一种形式,且在MDS患者中,正虚型患者处于气化功能减弱的轻症阶段,因其气化尚能代谢体内初步积累的瘀毒而病情平稳,而瘀毒型患者处于气化功能减弱的重症阶段,因其气化能力已不足以代谢体内堆积的瘀毒而致病情迅速恶化。研究方法本研究收集了符合条件的正虚型、瘀毒型MDS患者各20例及正常人20例,分别提取三组的外周血单个核细胞,使用免疫荧光显微镜观察三组细胞的自噬体数量,使用流式细胞仪检测三组细胞的自噬荧光强度,使用蛋白质免疫印迹法检测自噬相关蛋白LC3、Beclin1以及自噬底物蛋白p62的表达水平,使用酶标仪检测三组细胞的ROS荧光强度,使用SPSS 21.0统计软件对实验结果进行统计分析。同时,本研究选取MDS细胞株SKM-1,分为加药组和空白对照组同时培养,加药组加入自制扶正解毒复方三子黄石散药液干预24小时,使用免疫荧光显微镜观察三组细胞的自噬体数量,使用流式细胞仪检测两组细胞的自噬荧光强度,使用蛋白质免疫印迹法检测自噬相关蛋白LC3、Beclin1以及自噬底物蛋白p62的表达水平,使用酶标仪检测两组细胞的ROS荧光强度,使用SPSS 21.0统计软件对实验结果进行统计分析。研究结果第一部分MDS患者的自噬与ROS水平特点分析(1)流式细胞术对三组PBMC的自噬荧光强度检测发现,正虚组PBMC的自噬水平高于正常组(P<0.05);瘀毒组PBMC的自噬水平低于正常组(P<0.05);瘀毒组PBMC的自噬水平显著低于正虚组(P<0.001)。(2)蛋白质免疫印迹法对三组PBMC的自噬相关蛋白检测发现,正虚组PBMC的p62表达水平低于正常组(P<0.05),瘀毒组PBMC的p62表达水平高于正常组(P<0.05),瘀毒组PBMC的p62表达水平显著高于正虚组(P<0.001);正虚组PBMC的Beclin1表达水平高于正常组(P<0.05),瘀毒组PBMC的Beclin1表达水平低于正常组(P<0.05),瘀毒组PBMC的Beclin1表达水平低于正虚组(P<0.05);正虚组PBMC的LC3Ⅱ表达水平高于正常组(P<0.05),瘀毒组PBMC的LC3Ⅱ表达水平低于正常组(P<0.05),瘀毒组PBMC的LC3Ⅱ表达水平显著低于正虚组(P<0.001)。(3)酶标仪对三组PBMC的有毒代谢产物ROS荧光强度检测发现,正虚组PBMC的ROS水平显著高于正常组(P<0.001),瘀毒组PBMC的ROS水平显著高于正常组(P<0.001),瘀毒组PBMC的ROS水平与正虚组的差异无统计学意义(P>0.05)。第二部分三子黄石散对SKM-1细胞株的自噬与ROS水平的影响(1)流式细胞术对两组SKM-1细胞株的自噬荧光强度检测发现,加药组SKM-1细胞株的自噬荧光强度水平高于空白对照组(P<0.05)。(2)蛋白质免疫印迹法对两组SKM-1细胞株的自噬相关蛋白检测发现,加药组SKM-1细胞株的p62表达水平低于空白对照组(P<0.05),Beclin1表达水平高于空白对照组(P<0.05),LC3Ⅱ表达水平高于空白对照组(P<0.05)。(3)酶标仪对两组SKM-1细胞株的有毒代谢产物ROS荧光强度检测发现,加药组SKM-1细胞株的ROS水平显著低于空白对照组(P<0.001)。结论(1)不同证型MDS患者的自噬水平及有毒代谢产物ROS水平均存在差异:正虚型MDS患者的自噬水平和ROS水平均高于正常人,而瘀毒型MDS患者的自噬水平低于正常人,ROS水平高于正虚型MDS患者和正常人。(2)正虚型MDS患者的PBMC自噬量增加与ROS初步累积相关,且正虚型MDS患者PBMC尚有能力通过增加自噬量来与逐步累积的ROS抗衡;瘀毒型MDS患者的PBMC自噬量减少与ROS过量累积相关,且瘀毒型MDS患者的PBMC的自噬能力已绝对不足,无法与过量堆积的ROS抗衡。(3)结合中医气化理论对MDS证型及病机的解释,正虚型MDS患者处于气化功能减弱的轻症阶段,因其气化尚能代谢体内初步积累的瘀毒而病情平稳,而瘀毒型患者处于气化功能减弱的重症阶段,因其气化能力已不足以代谢体内堆积的瘀毒而致病情迅速恶化。(4)具有调整气化功能的扶正解毒复方三子黄石散能通过增加MDS细胞株SKM-1的自噬量来减少ROS。从而印证“自噬是气化的一种形式,扶正解毒复方能通过增强气化功能来调节自噬水平”的假说。