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前言:葎草始载于《名医别录》,药用历史悠久,在民间广泛应用。历代本草如《唐本草》、《开宝本草》、《本草纲目》等均有记载。当代很多医药书籍亦有收录。但国内外对葎草的化学成分、药理作用等未见深入的研究报道。本试验对葎草的化学成分进行了提取、分离和鉴定工作,得到葎草中主要的黄酮类成分为木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷(LGL)、大波斯菊苷(AGL)和牡荆素(VIT)三种;对不同季节和不同部位葎草中LGL和AGL的含量进行了测定,为葎草的采收季节和药用部位提供了理论依据;对葎草总黄酮(HSTF)和AGL在大鼠体内的药代动力学参数进行了测定,为其制备成适当的剂型而应用于临床奠定了理论基础;对HSTF、LGL和AGL的抑瘤作用进行了初步研究,发现LGL和HSTF对HepG2细胞有较强的抑制作用;通过小鼠肺水清除率试验,发现HSTF、LGL和AGL三种成分均能促进肺泡上皮细胞钠通道的开放而达到利水作用,为葎草利水消肿功效的现代临床应用打下坚实的理论基础。
目的:通过对葎草的研究,明确葎草中所含的黄酮类成分;明确葎草的最佳采集季节及药用部位;明确葎草中HSTF和AGL在大鼠体内的药代动力学特征;明确葎草中HSTF、LGL和AGL的相关药理作用。为葎草的进一步开发和应用打下坚实理论基础。
方法:
采用大孔吸附树脂技术、硅胶柱层析技术及制备液相技术分离纯化葎草的化学成分。
采用高效液相色谱法对不同季节及不同部位葎草中LGL和AGL的含量进行测定。
采用高效液相色谱法对HSTF和AGL在大鼠体内的药代动力学参数进行测定。
采用细胞培养和台盼蓝染色法探讨了HSTF、LGL和AGL对HepG2细胞增殖的抑制作用。
采用小鼠肺水清除率方法探讨了HSTF、LGL和AGL的利水作用及其作用机制。
结果:
葎草化学成分分离鉴定结果通过紫外光谱,红外光谱,核磁共振谱等确定所分离的4种有机单体成分分别为:LGL、AGL、VIT和尿嘧啶。同时,初步确定一种硝酸盐类无机物质为硝酸钾。
葎草化学成分含量测定结果通过高效液相色谱法测定可知:葎草中LGL和AGL含量在6～8月份较高。其中LGL含量在7月份最高,AGL含量在6月份最高。不同部位葎草中LGL和AGL含量由高到低依次为:叶＞茎＞叶柄＞根。
葎草化学成分药代动力学参数测定结果对SD大鼠单次静脉给予葎草总黄酮(HSTF)注射液,于给药后不同时间点测定血药浓度。经药代动力学软件处理得到不同剂量LGL的清除率(C1)从6.25～7.81L/h/kg,半衰期(t1/2)从1.43～2.43 h,表观分布容积(Vc)从15.99～21.89 L/kg;AGL的清除率(C1)从10.44～15.84 L/h/kg,半衰期(t1/2)从1.56～3.97 h,表观分布容积(Vc)从35.59～65.17 L/kg。对SD大鼠单次静脉给予AGL注射液,于给药后不同时间点测定血药浓度。经药代动力学软件处理得到不同剂量AGL的清除率(C1)从11.38～15.83 L/h/kg,半衰期(t1/2)从1.36～2.03 h,表观分布容积(Vc)从26.01～44.95 L/kg。
葎草化学成分抑瘤试验结果采用细胞培养和台盼蓝染色法测定葎草化学成分的抑瘤作用,当HSTF、LGL和AGL的浓度由6.25～100μM时,HepG2细胞活度分别为91.2％～5.5％,71.2％～4.8％,96.4％～78.8％。
葎草化学成分利水作用试验结果肺水清除率试验结果显示:5％BSA对照组AFC为29.8％;阿米洛利组AFC为20.8％(P＜0.05);特布他林组AFC为42.0％(P＜0.05);LGL组AFC为34.3％;LGL+阿米洛利组AFC为22.8％(P＜0.05);AGL组AFC为35.4％;AGL+阿米洛利组AFC为21.0％(P＜0.05);总黄酮组AFC为38.9％(P＜0.05);总黄酮+阿米洛利组AFC为26.7％(P＜0.05)。
结论与讨论:
葎草中所含有的黄酮类成分主要为LGL、AGL和VIT,其中VIT的含量较低。
葎草以黄酮类成分为物质基础的临床应用中,采集季节应该在6～8月份,葎草叶应该是主要药用部位。
建立的高效液相色谱法测定葎草中化学成分药代动力学参数的方法简便易行,可以用于测定HSTF和AGL在大鼠体内的药代动力学参数。HSTF和AGL适合制备成相关的剂型在临床上应用。
HepG2细胞活性抑制试验结果显示:HSTF和LGL对HepG2细胞活性抑制作用明显,并且呈剂量依赖关系,随着药物浓度的增加细胞活性降低。AGL对HepG2细胞活性的作用显著低于LGL和HSTF。文献报导黄酮类成分对于抗肿瘤细胞的增殖作用,其B环上C3,C4位上的两个邻位-OH对于抑制酶的活性是必需的。C2和C3之间的共轭双键使B环和C环在同一平面,有利于接近激酶底物结合位点,这两种结构对于黄酮类成分抗细胞增殖的活性至关重要,这与本试验结果相吻合。同时也能够解释LGL和AGL两个黄酮类化合物虽然只相差了一个-OH,但其药理作用却相差悬殊的原因。
肺水清除率(AFC)试验结果显示:阿米洛利作为上皮细胞钠通道的阻断剂,显著降低正常组小鼠肺水清除率约30.2％。这说明阿米洛利对钠通道的阻断作用使肺泡对水份的吸收作用受到抑制。而特布他林作为钠通道的开放剂,能够增加正常组小鼠的肺水清除率约40.9％。说明特布他林具有促进钠通道开放的作用,使肺泡上皮钠通道对水的通透性增强。HSTF组、LGL组和AGL组的肺水清除率与空白对照组相比均有增加,说明三者均有利水作用。而当三组成分分别加入阿米洛利后均能使肺水清除率降低,说明三组成分均存在促进钠通道开放的吸收机制,在有钠通道阻断药物存在的情况下,阻止了肺泡对水的吸收过程。