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核转录因子-κB(NF-κB)是一种广泛存在于无脊椎和脊椎动物的重要的转录调节因子。NF-κB通过调控多种靶基因的表达在炎症、免疫、氧化应激、细胞增殖、细胞凋亡等生理病理过程中起到重要作用。快速反应的先天性免疫在鱼类的免疫应答反应中起着重要的作用,NF-κB被激活后可以启动机体的先天免疫从而抵抗病原的入侵。草鱼是中国的主要淡水经济鱼类之一,在养殖过程中容易被病原感染造成经济损失。对草鱼NF-κB的研究有助于了解草鱼的免疫应答机制,为进一步阐明鱼类的先天性免疫机制奠定理论基础。本研究通过同源克隆和RACE方法克隆获得了草鱼的IKK激酶复合物的β亚基(CiIKKβ),以及草鱼NF-κB的三个亚基p65基因(Cip65),p105基因(Cip105)和c-Rel基因(Cic-Rel)。CiIKKβ全长cDNA为3428 bp,序列分析表明CiIKKβ具有典型的IKKβ蛋白结构特征,系统进化树结果表明Ci IKKβ在进化过程中与斑马鱼的亲缘关系最近。CiIKKβ在草鱼不同的器官组织中都有表达。Poly I:C刺激草鱼肾细胞(CIK)后,CiIKKβ表达量增加,表明CiIKKβ与细胞的抗病毒活动有关。Cip65的全长cDNA为2481 bp、Cip105的全长cDNA为3760 bp,Cic-Rel的全长cDNA为2618bp。序列分析结果表明草鱼的这三个NF-κB亚基在进化中保守。系统进化树的结果表明草鱼的这三个NF-κB亚基均与鱼类的亲缘性高。Poly I:C和LPS的刺激下,草鱼各组织中的Cip65,Cip105和Cic-Rel的表达水平均呈现上调,说明它们与草鱼的抗病毒或抗菌的生理过程有关。草鱼PKR(Ci PKR)通过介导细胞信号转导在抗病毒的免疫应答中发挥作用。为了分析CiPKR介导NF-κB信号通路的机制,利用免疫共沉淀(co-IP)和GST pull-down方法证明了CiPKR能与CiIKKβ直接结合,CiIKKβ能与草鱼NF-κB抑制蛋白α(CiIκBα)相互作用。这初步表明了CiPKR能够通过与CiIKKβ的结合来介导NF-κB信号通路,当然这还需要进一步研究。为了进一步研究草鱼的NF-κB经典信号通路,本研究设计构建了一系列带FLAG或HA标签的质粒载体进行co-IP和GST pull-down实验。结果表明Cip65能与Cip105或其剪切后形成的草鱼p50(Cip50)形成二聚体,Cip65和Cic-Rel均能与CiIκBα发生蛋白结合。以上结果表明了草鱼的NF-κB经典信号通路是存在的并且高度保守。为了分析草鱼的NF-κB经典信号通路的负反馈机制,利用5′-Full RACE方法确定了CiIκBα和Cip105的转录起始位点(TSS),通过锚定PCR的方法分别克隆得到CiIκBα和Cip105的启动子。其中在本研究中成功得到了距离转录起始位点414 bp的CiIκBα启动子序列,启动子序列分析结果表明该序列含有1个非典型TATA盒,2个RelA结合位点和2个NF-κB结合位点。本研究中得到距离转录起始位点1469bp的Cip105启动子序列,启动子序列分析结果显示该序列含有1个RelA结合位点,1个NF-κB结合位点和1个Sp1结合位点。同时为研究Cip65对CiIκBα和Cip105基因转录调控的机制,原核表达并纯化获得Cip65的ORF全长和截断蛋白。通过体外凝胶阻滞实验表明Cip65全长蛋白对CiIΚBα和Cip105启动子有亲和性。将pGL3-CiIκBα和pGL3-Cip105启动子荧光素酶报告基因载体质粒和pCDNA3.1-Cip65-ORF,pCDNA3.1-Cip65-ΔC,pCDNA3.1-Cip65-ΔN真核表达载体质粒分别共转染CIK细胞,检测荧光素酶的活性。结果表明在CIK细胞中Cip65-ORF能够增强CiIκBα和Cip105的转录活性。