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一、氟尿嘧啶诱导大鼠卵巢损伤模型的建立目的:建立氟尿嘧啶诱导的大鼠卵巢损伤模型。方法:选取具有正常动情周期的8~10周龄雌性SD大鼠20只,随机均分为4组:生理盐水对照组、5-FU低、中、高剂量组:分别接受生理盐水1ml·kg-1·d-1和5-FU 5 mg·kg-1·d-1、10 mg·kg-1·d-1、20 mg·kg-1·d-1腹腔注射,连续14天。每天进行大鼠阴道涂片监测动情周期,并于给药前、停药时、停药2周剪尾取血1ml检测血清AMH、FSH和E2水平,同时记录大鼠一般情况。于停药时和停药2周分批处死大鼠,取其双侧卵巢组织称取湿重,进行石蜡包埋,组织切片后进行HE染色,光学显微镜下统计各级卵泡数目。结果:5-FU处理组大鼠体重均有不同程度下降,饮食量也明显减少,低、中、高剂量组平均饮食量由正常18~20g/只分别降为15g/只、12g/只、9g/只。饮水量及小便量增加。用药后生理盐水组大鼠有正常动情周期(4~5天),低剂量组虽有动情周期,但由4~5天延长至7~8天。中剂量组给药第9天,高剂量组给药第5天出现动情周期紊乱:动情间期延长,动情期缩短,直至不出现动情期。给药前各组血清各激素水平均无差异(P>0.05)。停药时,较生理盐水组相比,低、中、高剂量组血清各项性激素均出现不同程度改变,FSH升高明显(P<0.05),E2降低明显(P<0.05),AMH降低明显(P<0.05),生长卵泡和原始卵泡数目均较生理盐水组明显减少(P<0.05),除低剂量组卵巢湿重减轻较明显外(P<0.05),中、高剂量组变化并不明显(P>0.05)。停药2周,较生理盐水组相比,除低剂量组FSH降至正常外,其余组各项性激素改变仍明显(P<0.05),生长卵泡和原始卵泡数目均较生理盐水组明显减少(P<0.05),中、高剂量组卵巢湿重明显减轻(P<0.05)。停药2周和停药时相比,各组各项激素变化以及原始卵泡和生长卵泡变化均不明显,差异无统计学意义(P>0.05),但高剂量组卵巢湿重明显减轻(P<0.05)。结论:5-FU能够引起血清E2、FSH和AMH水平的改变,导致大鼠正常动情周期紊乱甚至消失。故可以应用5-FU 20mg/kg建立卵巢损伤的大鼠模型。二、Gn RHa对化疗致卵巢损伤的保护作用目的:探讨Gn RHa对5-FU诱导大鼠卵巢损伤的保护机制。方法:将具有正常动情周期的雌性SD大鼠随机分为生理盐水对照组(10只)、5-FU组(15只)、曲普瑞林+5-FU组(10只)、曲普瑞林+生理盐水组(10只)四组(分别标记为A、B、C、D)。A组:给予1ml·kg-1生理盐水腹腔注射,间隔1天,一共14次。B组:5-FU按20mg·kg-1剂量腹腔注射,间隔1天给药,一共14次。C组:分别于实验前14天及给予5-FU后14天,按0.1mg·kg-1剂量曲普瑞林,深部肌肉注射,5-FU的用法及用量同B组。D组:曲普瑞林用法及用量同C组,生理盐水用法及用量同A组。实验前、给药第14天、28天和停药1周、2周时留取各组血标本,用于测定血清中的AMH、FSH和E2水平,并在停药1周和2周时动情间期分批处死大鼠,取两侧卵巢,称取湿重。一侧卵巢组织用10%中性福尔马林溶液固定,进行石蜡包埋。连续5μm切片后HE染色,光镜观察并计数各期卵泡数目及免疫组化检测Bcl-2和Bax蛋白表达情况。另一侧卵巢组织用于提取蛋白,进行Western-Blot实验。试验期间每天进行阴道脱落细胞涂片观察大鼠动情周期。结果:①大鼠动情周期变化:A组均为正常动情周期。B组给予5-FU后经过1次完整动情周期后出现动情周期紊乱,继续给药后甚至不出现动情期,仅有动情间期。停药1周时均未恢复正常动情周期;停药2周时,21.6%恢复正常动情周期(3/14)。C组和D组在应用曲普瑞林后经过1次完整动情周期后不再出现动情期。C组停药第3天先出现动情周期延长至10天,随后逐渐恢复正常动情周期,D组停药第4~5天恢复正常动情周期。②血清激素水平变化:实验前各组血清AMH、E2和FSH浓度没有明显差异(P>0.05)。给药第14天,B组血清AMH和E2浓度较其余三组明显下降(P<0.05),血清FSH浓度虽有所升高,但差异不明显(P>0.05);C组AMH水平较A组下降明显(P<0.05)。给药第28天,B组血清AMH、E2和FSH浓度均较其余三组差异显著(P<0.05);C组仅AMH水平较A组下降明显(P<0.05),E2和FSH下降并不明显(P>0.05)。停药1周和2周时,B组血清AMH和E2水平较给药结束时均有所升高,血清FSH有所下降,但仍与其余三组有显著差异(P<0.05);C组较A、D组差异均不明显(P>0.05)。③大鼠卵巢湿重比较:停药1周时,B组卵巢湿重明显比A组减轻(P<0.05);停药2周时,B组卵巢湿重虽有增加,但仍然轻于其余组(P<0.05),C组与D组相比无明显差异(P>0.05)。各组间前后比较均没有明显变化(P>0.05)。④原始卵泡和生长卵泡计数:停药1周时:B组原始卵泡比A组明显减少(P<0.05),B、C、D三组生长卵泡均比A组明显减少(P<0.05),C和D组的原始卵泡比A组原始卵泡明显增加(P<0.05)。停药2周时:B组原始卵泡数目虽较停药1周时有所增加,但和其余三组相比差异明显(P<0.05);C和D组则有所减少,接近A组(P>0.05);除A组外,各组生长卵泡数目均比停药1周时有所增加,但B组明显低于A组(P<0.05),C组和D组接近A组(P>0.05)。原始卵泡和生长卵泡的各组间前后比较均没有明显变化(P>0.05)。⑤卵巢组织中Bcl-2和Bax蛋白表达情况:B组Bax蛋白表达上调,Bcl-2蛋白表达下调,致使Bcl-2/Bax比例降低;而C组则刚好相反,Bcl-2蛋白表达上调,Bax蛋白表达下调,Bcl-2/Bax比例升高。结论:①卵巢功能损伤初期,血清AMH的变化比E2和FSH的变化更灵敏,可以作为判断卵巢功能损伤的指标之一。②Gn RHa可能通过储备原始卵泡,减少发育中卵泡对化疗药物的敏感性,起到保护卵巢功能的作用。③Gn RHa可能通过上调Bcl-2表达和下调Bax表达,调节Bcl-2/Bax比例,在卵巢组织中发挥抗凋亡的作用。