目的：　　 大量的研究表明适度的卡路里限制(Calorie Restriction,CR)能延缓衰老,延长生命周期[1,2]。和CR相关的信号通路主要有三条:Akt/PKB,Tor,Ras。降低Akt/PKB,Tor,Ras的活性能在多种有机体内延长生命周期,这说明长寿的潜在机制在多种真核生物中的保守性[3,6]。　　 cyr1是编码腺苷酸环化酶(AC)的基因,AC催化ATP产生cAMP,从而激活cAMP依赖的蛋白激酶活性。与营养信号、细胞周期、细胞生长、孢子形成、压力抵抗和长寿有关。cyr1突变之后,AC/cAMP/PKA途径被阻断而引起压力抵抗转录因子Msn2/4的增强,进而导致长寿。Ras/cAMP/PKA也调节细胞骨架Actin的稳定,细胞骨架的稳定是细胞维持正常的生命周期的必要条件。细胞骨架Actin通过cAMP通路调节着酵母细胞中线粒体功能,导致ROS的累集和凋亡等[4]。　　 PIL1是eisosome的主要成分,和Pkh1/2共同定位内吞点。PIL1是LCB敏感的蛋白激酶抑制剂。PIL1是由PHK激酶介导的LCB的靶蛋白。PKH过表达,PIL1高度磷酸化,eisosome解聚,从而影响到细胞的内吞。既然PIL1和细胞骨架都与内吞都有联系[5],而细胞骨架的集聚又可以使RAS信号通路过度活化而引起酵母细胞的一系列衰老现象[4]。因此我们假设PIL1在cyr1突变菌中影响了生命周期的延长。本实验以cyr1突变菌为材料来集中研究PIL1在Ras/cAMP/PKA通路中的作用。　　 材料与方法　　 酵母菌:　　 以DBY746为背景菌,WT　　 单突变菌cyr1::mTn ras2△ pill△　　 双突变菌cyr1::mTn pill△ ras2△ pill△　　 质粒:　　 将质粒YCplac22-PIL1(含PIL1蛋白开放阅读块和启动子)转入双突变菌组内,得到cyr1::mTn pill△/PIL1和ras2△ pill△/PIL1。　　 将质粒YCplac22-CYR1(含CYR1蛋白开放阅读块和启动子)转入cyr1::mTn内,得到cyr1::mTn/CYR1。　　 培养基:　　 采用Longo’s Aging medium[5]以2％的葡萄糖作为碳源。首先挑选新鲜的克隆,以2ml的Aging培养基得到SONC(saturated overnight culture)。以起始OD=0.1组成25ml的培养液,放入125ml的培养瓶中,220rpm进行培养。3天后,细胞达到稳定期并停止分裂,但是仍然存活,我们视之为第一天(Day 1)。　　 CLS测定:Chronological life span assay[3]　　 从第一天开始,每隔2-3天取50微升的菌液稀释10000倍后涂抹于YPD培养板上,30℃培养2天后,计克隆数。　　 过氧化氢抵抗:　　 取1OD细胞用135mM H2O2在室温下处理一小时,做10倍系列稀释,涂在YPD板上(1％ yeast extract,2％peptone,1.5％agar和2％glucose)30℃培养2-3天。拍照观察克隆稠密情况。　　 Caspase活性测定:　　 CaspACE-FITC-VAD-FMK定位,以终浓度5-10μM避光染色20min,PBS洗3次后进行流式细胞术(488nm,452-450nm)。　　 误差控制:　　 所有培养瓶规格,操作均统一,设置3组平行对照,以减少误差。　　 结果　　 pil1的敲除对cyr1突变菌的影响是显著地:在cyr1突变菌中敲除pil1基因,则原本长寿型的cyr1突变菌的生命周期缩短,对过氧化氢的抵抗能力下降,且原本较低的半胱天冬酶活性维持在高水准,凋亡指标与WT野生型酵母类似。而在ras2的突变菌中没有发现类似的现象。　　 结论　　 PIL1与cyr1突变菌的长寿现象有关；但对ras2△菌种无显著影响。