背景和目的 肿瘤的传统治疗方法有手术、放疗和化疗，但它们均不能彻底清除体内的瘤细胞，而免疫治疗借助于调节肿瘤细胞和宿主免疫反应，刺激免疫系统识别和杀伤肿瘤细胞。其中，体内回输免疫活性细胞的过继免疫疗法具有一定的抗肿瘤效果。与其它的抗肿瘤药物相比，它对机体免疫系统的结构和功能不产生损伤，可以直接杀伤肿瘤细胞，并且调节和增强机体的免疫功能，因而成为治疗肿瘤的重要辅助手段，为预防肿瘤复发，改善晚期患者的生存质量提供了新途径。为了达到更好的抗肿瘤效果，用于过继免疫疗法的免疫活性细胞必须具有较强的细胞毒活性和增殖能力。许多体内外实验证实，淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)和肿瘤浸润的淋巴细胞(TIL)有较强的细胞毒活性，但LAK和TIL在体外增殖率较低。近来研究表明，与LAK和TIL相比，细胞因子激活的杀伤细胞(CIK)具有增殖率高、细胞毒活性强、抗瘤谱广等特点。在荷瘤鼠模型(H-22腹水瘤、克洛氏肉瘤)中，CIK细胞有抗肿瘤作用及抗肿瘤转移作用；在严重联合免疫缺陷小鼠／淋巴瘤模型中，CIK细胞能够有效抑制淋巴瘤的发生，并且能够部分根除淋巴瘤细胞；从病人体内分离培养的CIK细胞，在体外有强的杀伤K562细胞和裂解髓系白血病细胞的作用；转染有IL-2基因的CIK细胞回输给具有转移灶郑州大学2003届硕士毕业论文PHA对CIK细胞增殖和细胞毒活性影响的研究的肾癌、结肠癌和淋巴瘤病人，进行I期临床试验，发现病人血清中IFN一Y、GM一CSF和TGF一p的水平明显增高，外周血中的CD3+淋巴细胞增多，外周血淋巴细胞的细胞毒活性比治疗前有部分提高。随着对CIK细胞研究的进展一，人们正逐渐改进CIK细胞的体外培养和处理方法，以便进一步提高CIK细胞的增殖率及细胞毒活性。植物血凝素(PHA)是T细胞的多克隆活化剂，可刺激静止期T细胞转化为淋巴母细胞，临床上可以作为免疫调节剂。本实验拟用PHA先刺激外周血单个核细胞24小时，再按常规CIK细胞培养方法继续培养，探讨PHA的加入能否提高CIK细胞的增殖率及细胞毒活性，为临床应用提供理论和实验依据。方法 从正常健康人外周血分离单个核细胞，每例标本分为两组进行培养。一组按常规CIK细胞培养方法，即第0天加入IFN一Y(1 000U/ml)，入培养箱孵育24小时后再加入IL一2(300u/ml)、抗en3单抗(25ng/ml)继续培养。另一组于第o天加入PHA(20 pg/ml)，24小时后按常规cIK细胞培养方法继续培养。每3一4天根据细胞浓度添加新鲜RPMn 640完全培养液(内含10%自体血浆、25nuno比Hepes、looU/1 nl青霉素、looU/I nl链霉素)，并补加IL一2至300u/ml。培养过程中动态观察细胞形态学变化。培养至第15天，留取细胞进行各项检测:①作瑞氏染色、糖原染色和细胞活力测定。②细胞计数，测其增殖倍数。③各组细胞均用流式细胞仪检测细胞免疫表型，用单抗CD3、CD4、CDS、CD56、CD19作标记。④用K562细胞株、食管癌细胞株和初治急性白血病病人的骨髓幼稚细胞作为靶细胞，用MTT法检测CIK细胞、PHA一CIK细胞的细胞毒活性。结果1.在培养过程中，两组细胞的胞体和胞核均增大，胞浆增多，部分细胞胞浆中出现颗粒、空泡，染色质变细，可见核分裂相和许多淋巴样细胞簇团样集聚成细 郑州大学2003届硕士毕业论文PHA对CIK细胞增殖和细胞毒活性影响的研究胞岛，进行糖原染色发现阳性颗粒较多，且颗粒粗大。2.CIK细胞的增殖倍数为12.59士1.55，PHA一CIK细胞的增殖倍数为25.63士2.25，两组之间相比差异有统计学意义(p<0.001)。3.培养后，两组细胞中各细胞亚群所占百分数不同。两组细胞之间相比，CD3+、CDS+、CD3+CDS+、CD3‘CD56+细胞比例差异有统计学意义(P<0.05)，CD3+CD4+、CD3+CD56+细胞比例差异无统计学意义(P>0.05)。加入PHA后，可引起细胞群体中CD3+、CDS+细胞比例明显增多，CD3一CD56+细胞比例明显减少，而对CD3十CD4+、eD3+eD56+细胞比例无明显影响。4.两组细胞均有强的细胞毒活性，靶细胞不同时杀伤强弱不同;在相同较高的效靶比下，PHA一CIK细胞比CIK细胞对K562细胞和初治急性白血病病人的骨髓幼稚细胞有更强的杀伤作用(尸<0.05)。结论PHA可以增加CIK细胞的增殖率，明显提高CIK细胞培养物中CD3十、CDS+、CD3十CD56+细胞数量，增加CIK细胞的细胞毒作用，可为临床免疫治疗提供足量和高效的免疫细胞。2.用自体血浆可以成功培养CIK细胞，用于临床治疗比较安全。