【摘 要】
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细菌性疾病是中华鳖(Trionyx sinensis)养殖中的常见疾病,严重威胁着中华鳖的健康养殖,其所引起的疾病感染通常会导致中华鳖养殖产业巨大的经济损失。本研究从湖北仙桃某中华鳖养殖场的多批患病中华鳖中分离获得了多株病原菌,以此为材料,对分离株进行鉴定,通过回归感染实验验证了其是引起中华鳖感染发病的致病菌,并对分离株的表型和全基因组进行了分析,进一步探究了中草药提取物黄芩苷对中华鳖感染嗜水气单
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细菌性疾病是中华鳖(Trionyx sinensis)养殖中的常见疾病,严重威胁着中华鳖的健康养殖,其所引起的疾病感染通常会导致中华鳖养殖产业巨大的经济损失。本研究从湖北仙桃某中华鳖养殖场的多批患病中华鳖中分离获得了多株病原菌,以此为材料,对分离株进行鉴定,通过回归感染实验验证了其是引起中华鳖感染发病的致病菌,并对分离株的表型和全基因组进行了分析,进一步探究了中草药提取物黄芩苷对中华鳖感染嗜水气单胞菌的保护效果,以此为中华鳖的健康养殖和病害防控奠定基础。主要研究结果如下:(1)鳖源铜绿假单胞菌和嗜水气单胞菌的分离与鉴定本研究对湖北仙桃某中华鳖养殖场多批次的发病中华鳖进行了病原分离。第一批次发病的中华鳖表现为:发病前期食欲下降、不进食,随后出现了体表出血、背部唇边腐烂偶伴有便血现象,解剖后发现腹腔有出血和大量腹水,肝脏脂肪化和肿大,有些肝脏伴有发黑症。第二批次发病的中华鳖表现为行动力下降,背壳有外伤伴有发炎腐烂,底板发红、有大量的出血点,解剖后的肝脏有发白、纤维化的现象。通过16S r RNA基因序列分析、扫描电镜观察、生理生化鉴定、及人工回归感染实验,发现两批次的中华鳖致病菌分别主要为铜绿假单胞菌和嗜水气单胞菌。对于第一批次分离获的3株铜绿假单胞菌,药敏实验结果显示,3株菌均对头孢他啶等8种抗生素敏感,对氟苯尼考、强力霉素、磺胺异恶唑等6种抗生素耐药;多位点序列分析发现,3株分离株均属于ST252型,e BURST分析进一步显示ST252型与一些来源于英国、澳大利亚等ST共同构成了克隆复合体CC252,且ST252是CC252的原始序列型。对于第二批次分离获的嗜水气单胞菌,药敏实验结果显示其对喹诺酮类、头孢烯类、内酰胺类、碳青霉烯类、氨基糖苷类的药物表现为敏感,对水产用药物中的新霉素、恩诺沙星、诺氟沙星、氟苯尼考敏感,对磺胺异恶唑耐受。(2)铜绿假单胞菌FG10和嗜水气单胞菌B3的全基因组分析铜绿假单胞菌FG10的全基因组测序结果显示,全基因组大小为5.65 Mb,GC含量为65.30%,预测到5956个编码序列(CDS),Gen Bank登录号JAJGXC000000000。通过与毒力因子数据库(Virulence Factor Database,VFDB)比对,预测到873个毒力相关因子,主要与黏附、分泌系统以及毒素等相关。通过与耐药基因数据库(the Comprehensive Antibiotic Resistance Database,CARD)比对,结果显示FG10中含有喹诺酮类、碳青霉烯类、肽类等抗生素的耐药相关基因。嗜水气单胞菌B3的全基因序列总长度为4.90 Mb,GC含量为60.79%,共预测到4660个CDS。通过与毒力因子数据库比对,在B3全基因组中共预测到648个毒力相关基因,主要与黏附、毒素、分泌系统、铁摄取系统、双组分系统等相关。与耐药基因数据库比对发现,B3基因组中耐药基因主要与氨基糖苷类、喹诺酮类、肽类等抗生素耐药相关。(3)黄芩对中华鳖感染嗜水气单胞菌的保护效果通过抗生素平板扩散实验等发现,黄芩(Scutellaria)和黄芩的主要有效成分黄芩苷(Baicalin)对嗜水气单胞菌B3的生长有明显的抑制作用。在饲料中添加含有黄芩的饲料添加剂,饲喂3个月后,通过嗜水气单胞菌菌株B3攻毒实验发现,与未添加黄芩的对照组相比,黄芩组的中华鳖死亡率显著降低,且黄芩组中华鳖免疫相关基因myd88、il6、c3a、dusp7的表达也要显著高于对照组(p<0.001),表明饲料中添加黄芩可以显著提高中华鳖的免疫力、降低中华鳖感染嗜水气单胞菌的死亡率。同时发现,黄芩组与对照组相比,并不能对中华鳖的生长起到促进作用(p<0.001)。肠道微生物多样性分析发现,与未添加黄芩的对照组相比,黄芩组中华鳖的肠道微生物组成多样性较为单一。
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