论文部分内容阅读
目的:枳术丸作为中医治疗功能性消化不良（FD）的良方,方中使用白术生、制品的情况较为混乱。因此,为了保证枳术丸的质量及临床疗效。本文从体内外化学成分变化的角度,通过对生、制白术制枳术丸化学成分的组成、主要活性成分的含量及药代动力学行为进行比较,再结合相关药效学研究的结果,从而明确枳术丸中应使用生白术还是制白术,并深入解析其中的炮制机理。方法:1.采用超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱（UHPLC-Q/TOF-MS）技术结合UNIFI1.9.4天然产物分析平台,对生、制白术制枳术丸中化学成分进行组成及结构的分析;同时,采用多元统计分析的方法,利用SIMCA-P和EZinfo 2.0软件,通过正交偏最小二乘-判别分析（OPLS-DA）的方法寻找生、制白术制枳术丸中的差异性标志物,从体外化学成分变化的角度解析枳术丸中用生、制白术的炮制机理。2.采用超高效液相色谱技术（UHPLC）,以白术內酯I、白术內酯II、白术內酯III、橙皮苷、柚皮苷、芸香柚皮苷、柚皮素、橙皮素、辛弗林、荷叶碱10种活性成分为指标,比较白术及其生、制品所制备的枳术丸中上述活性成分的差异,从主要活性成分含量变化的角度解析枳术丸中用生、制白术的炮制机理。3.采用超高效液相色谱串联质谱（LC-MS）技术,比较生、制白术制枳术丸中白术內酯I、白术內酯III、辛弗林、荷叶碱、芸香柚皮苷、柚皮苷和橙皮苷7种活性成分在大鼠体内的吸收、组织分布和排泄三个方面的差异,从主要活性成分在体内的药动学行为角度解析枳术丸中用生、制白术的炮制机理。4.采用过度疲劳、饮食失节与夹尾刺激相结合的方式建立FD脾虚证模型,考察生、制白术制枳术丸对模型大鼠的行为学及血清中血管活性肠肽（Vasoactive intestinal peptide,VIP）、胆囊收缩素（Cholecystokinin,CCK）、降钙素基因相关肽（Calcitonin gener-elated peptide,CGRP）、皮质酮（Cortisone,CORT）、5-羟色胺（5-hydroxytryptamine,5-HT）、一氧化氮（Nitric oxide,NO）水平影响的差异,从药效作用的角度解析枳术丸中用生、制白术的炮制机理。结果:1.采用UHPLC-Q/TOF-MS技术对枳术丸中化学成分的组成与结构进行了分析。最终,在生、制白术制枳术丸中共鉴定出94种化合物,包括正离子模式下78种,负离子模式下16种,主要涵盖黄酮类、香豆素类、烯炔类、酚酸类、倍半萜类、生物碱和皂苷类8大类。其中,尤以黄酮类化合物居多,共30个;将色谱技术与多元统计分析相结合,确定了生、制白术制枳术丸间的差异性成分共有27种,正离子模式下的差异性成分有20种,负离子模式下的差异性成分有7种,包括酚酸类、香豆素类、黄酮类、生物碱类和倍半萜类6类。其中,酚酸类、香豆素类、黄酮类成分在制白术制枳术丸中含量增加,而生物碱类和倍半萜类成分在制白术制枳术丸中含量降低。2.采用UHPLC法建立了枳术丸中10种活性成分的含量测定方法,各成分的质量浓度和峰面积均呈良好的线性关系（r＞0.999）;方法的精密度、稳定性和重复性的RSD均＜3.58%;平均加样回收率在97.5%～100.6%之间;RSD在1.89%～3.16%之间。同时,比较生、制白术与麸炒枳实配伍后枳术丸中主要活性成分的变化趋势。结果发现,白术与枳实配伍可明显促进白术内酯III向白术内酯I的转化,麸炒白术可更有效的提高麸炒枳实中黄酮苷及生物碱类成分的含量,表明枳术丸以麸炒白术与麸炒枳实配伍的合理性。3.药代动力学结果:（1）体内吸收:大鼠灌胃给药生、制白术制枳术丸乙醇提取物后,相比于生白术制枳术丸组,制白术制枳术丸组大鼠血浆中辛弗林、芸香柚皮苷和柚皮苷的最大血药浓度Cmax均有不同程度的升高,辛弗林、芸香柚皮苷、柚皮苷和橙皮苷的药-时曲线下面积AUCo-t也有增加的趋势;白术內酯I、白术內酯III、荷叶碱和橙皮苷的Cmax和AUCo-t则呈下降的趋势。其中,白术內酯I的Cmax相较于白术內酯III下降的更明显。（2）组织分布:大鼠灌胃给药生、制白术制枳术丸乙醇提取物后,7种活性成分在胃、大肠、小肠分布居多,黄酮苷类（芸香柚皮苷、柚皮苷）及生物碱类成分（辛弗林）在制白术制枳术丸组中的含量明显高于生白术制枳术丸组。同时,通过分析比较5个不同时间点下大鼠主要效应器官中7种活性成分的浓度变化,发现各成分在0.75h和1.5h时可达到峰值。（3）排泄动力学:大鼠灌胃给药生、制白术制枳术丸乙醇提取物后,相比于生白术制枳术丸组,制白术制枳术丸组7种活性成分在48h的总尿排泄率小于生白术制枳术丸组,而白术经麸炒后7种活性成分的总粪便排泄率要明显高于生白术制枳术丸组。4.生、制白术制枳术丸对FD脾虚证模型大鼠的行为学指标、胃肠激素及神经递质水平影响的结果显示,与空白组相比,模型组大鼠血清中的VIP、CCK、NO、5-HT、CORT和CGRP含量均有显著性变化;与模型组相比,灌胃给药莫沙必利阳性药和生白术制枳术丸和制白术制枳术丸后,大鼠血清中的CCK和5-HT含量增加,NO、CORT、CGRP和VIP含量降低,且制白术制枳术丸给药组的效果要优于生白术制枳术丸给药组和莫沙必利阳性对照组。结论:1.枳术丸中含有黄酮类、香豆素类、烯炔类、酚酸类、倍半萜类、生物碱和皂苷类,共8类化合物。其中,酚酸类和生物碱类化合物是生白术制枳术丸及制白术制枳术丸间主要的差异性成分。2.麸炒白术与麸炒枳实配伍制备枳术丸可增加所含活性成分的含量。其中,麸炒白术与麸炒枳实配伍的枳术丸可促进白术内酯III向白术内酯I的转化,增强枳术丸益气健脾的功效。同时,还可增加黄酮苷及生物碱类成分的含量,保证枳术丸健脾消食的功效。3.麸炒白术与麸炒枳实配伍的枳术丸更利于活性成分在体内的吸收、分布及排泄,主要通过保护枳实中的黄酮苷、生物碱类成分以及白术中倍半萜内酯类成分的溶出及吸收,减少对胃肠道的刺激作用;同时,还可促进上述活性成分从粪便中排出,以减少对肾脏的损害。4.麸炒白术与麸炒枳实配伍的枳术丸对FD脾虚证模型大鼠具有更好的治疗效果。该作用主要通过调节肠道蠕动,修复神经元的损伤和促进胃肠激素的分泌而改善肠胃功能,以达到对FD脾虚大鼠的治疗作用。