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背景和目的:动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是一种慢性炎症反应,会增加患心血管疾病的风险,而心血管疾病是全球范围内死亡的主要原因。其病理学特征主要是内皮功能障碍以及在血管内膜上逐渐积累脂质、坏死细胞碎片和细胞外基质蛋白,最终导致血管闭塞或血栓形成并发症。目前在动脉粥样硬化病变中已经发现许多免疫细胞浸润,在对抗原性物质的局部炎症或免疫应答中这些免疫细胞被激活。并且在动脉粥样硬化血管的局部组织和周围系统中发现包括肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF-α),白细胞介素1a(IL-1a),白细胞介素1b(IL-1b),白细胞介素4(IL-4)、干扰素-c(IFN-c)和白细胞介素18(IL-18)等炎症细胞因子。其中动脉粥样硬化斑块中IL-18的表达水平较高,IL-18通过与靶细胞膜上特异性受体结合激活相应的信号途径而发挥作用,并且IL-18结合蛋白(Interleukin 18 binding protein,IL-18BP)能够降低动脉粥样硬化斑块形成风险,提示IL-18在动脉硬化发病中可能发挥重要作用。IL-18处理血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC),探讨IL-18对血管平滑肌细胞中TNF-α、IL-6、IL-8的表达,并初步探讨可能的分子机制,为动脉粥样硬化的预防和治疗的研究提供新的机制。方法(1)由生化教研室陈兵老师惠赠的小鼠血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC),转染了SV40大T抗原(SV40 large T antigen)后永生化的VSMC细胞株。小鼠血管平滑肌细胞(VSMC)来自于实验室保存,从液氮中复苏鼠VSMC,培养传代;(2)浓度变化的鼠IL-18(0、3、10、30、100ng/ml)处理VSMC 12 h,加入TRIZOl裂解细胞并提取总RNA,实时荧光定量PCR扩增分析目的基因(TNF-α、IL-6、IL-8)表达,分析加药处理的浓度相关性;以不同时间(0、2、6、12、18、24 h)加入IL-18(30 ng/ml)处理VSMC,以相同的方法扩增目的基因的表达,分析加药处理的时间相关性。(3)IL-18(30ng/ml)处理VSMC培养3d,收集细胞上清液,ELISA法分析VSMC上清液中的目的蛋白(IL-6、IL-8、TNF-α)的表达情况。(4)不同时间(0、10、30、60、120 m)加入IL-18(30 ng/ml)处理VSMC,提取细胞总蛋白,Western Blot法分析p38MAPK及PI3K/AKT信号通路中pp38及p AKT的表达变化。(5)特异性抑制剂SB203580(10μM,p38MAPK抑制剂)及LY294002(50μM,PI3K/AKT抑制剂)处理VSMC细胞,提取细胞总蛋白,Western Blot法分别分析pp38及p AKT的表达变化,同时ELISA法分析VSMC上清液中其对IL-18诱导细胞因子(IL-6、IL-8、TNF-α)表达的影响。(6)IL-18(0,3,10,30,100 ng/ml)处理VSMC 72 h,分析IL-18浓度相关性。(7)IL-18(30ng/ml)处理VSMC(0、1、2、3、4、5 d),MTS检测各组细胞存活率情况,流式细胞术可以检测各处理组细胞周期和细胞凋亡的变化;提取细胞总蛋白,蛋白质印迹法获得细胞周期、细胞凋亡相关蛋白表达变化。结果(1)Real-time PCR检测的结果发现IL-18能促使VSMC中TNF-α、IL-6、IL-8的m RNA水平表达量增加,并且与IL-18的浓度成正相关(p<0.05);IL-18(30 ng/ml)能够促使VSMC中TNF-α、IL-6、IL-8的m RNA水平表达增加,且24 h内表达量与时间成正相关(p<0.05)。即TNF-α、IL-6、IL-8的m RNA水平表达量与IL-18具有剂量和时间依赖性。(2)ELISA法的结果分析发现IL-18能够显著增加VSMC上清液中TNF-α、IL-6、IL-8的蛋白质水平的表达(p<0.05)。(3)Western blot的结果分析显示IL-18能够增加VSMC中pp38及p AKT的表达水平,其峰值分别在60 min、120 min。(4)SB203580对IL-18处理后的细胞其pp38表达量降低,LY294002对IL-18处理后的细胞其p AKT表达量也降低。即SB203580及LY294002分别特异性部分阻断IL-18激活的p38MAPK及PI3K/AKT信号途径。SB203580(10μM,p38MAPK抑制剂)部分阻断IL-18诱导TNF-α、IL-6、IL-8的表达;LY294002(50μM,PI3K/AKT抑制剂)部分阻断IL-18诱导TNF-α、IL-6、IL-8的表达(p<0.05)。(5)IL-18浓度变化影响VSMC细胞存活率效果不明显;(6)MTS实验结果表明:IL-18(30 ng/ml)处理VSMC 1 d、2 d、3 d、4 d、5 d后,其对VSMC的细胞存活率作用效果也不显著。(7)细胞周期分析结果显示,IL-18处理VSMC 1d、2d、3d、4d、5d后,G1、S、G2各期的VSMC细胞比例与对照组相比五个时间点均无显著性差异。(8)IL-18诱导VSMC细胞凋亡分析发现:IL-18(30 ng/ml)处理VSMC后,实验组(1d、2d、3d、4d、5d)诱导凋亡作用无明显差异。(9)Western Blot结果表明IL-18处理后细胞周期相关蛋白Cyclin B1、Cyclin E及p21变化无统计学意义;IL-18处理VSMC部分下调抑凋亡蛋白Bcl-2和部分上调促凋亡蛋白Bax。结论IL-18体外增加血管平滑肌细胞中TNF-α、IL-6、IL-8三种炎症因子表达,其机制部分依赖p38和PI3K/AKT信号通路的活化。该结果可能有助于阐明IL-18在动脉粥样硬化发生发展中的部分作用机制,为寻找动脉粥样硬化新的防治措施奠定基础。