论文部分内容阅读
富含鸟嘌呤碱基的DNA或者RNA能够形成一种特殊的核酸二级结构:G四链体结构。该结构广泛存在于真核生物、原核生物以及病毒的基因组中，具有重要的生物学功能，如影响DNA的复制、转录和翻译，参与了众多的生理病理过程。伪狂犬病(pseudorabies，PR)是由伪狂犬病毒(pseudorabies virus，PRV)引起的一种仔猪致死率高，怀孕母猪流产，并伴有神经紊乱症状的急性传染病。PRV基因组的GC含量高达70～80％，我们推测该病毒的基因组中存在形成G四链体结构的序列。EP0作为PRV的一个早期蛋白，对病毒其他基因的表达具有非常重要的调控作用，然而目前关于EP0基因的表达调控还知之甚少。
通过生物信息学分析，我们发现EP0基因的启动子区域存在富含鸟嘌呤碱基的序列，该序列包含三个重叠的Sp1结合位点。圆二色光谱和凝胶电泳分析，发现该序列可以形成G四链体结构。硫酸二甲酯足迹保护试验和Taq聚合酶延伸阻滞试验表明，该序列的G四链体结构具有多态性。进一步利用FRET melting、凝胶电泳、以及Taq聚合酶延伸阻滞试验的方法，验证了小分子配体PDS可以诱导形成并且稳定G四链体结构。荧光素酶报告基因试验发现，G四链体结构对EP0启动子活性具有负调控作用。
EP0启动子区域中的Sp1结合位点的突变导致了其启动子活性的降低。为了探索该机制，接下来我们检测细胞转录因子Sp1对含有G四链体结构和不含G四链体结构DNA的识别和结合能力的差异。我们将Sp1基因与六种增加蛋白质可溶性的标签连接构建原核表达载体，并通过原核表达系统纯化目的蛋白，得到了纯度较高的融合蛋白MBP-Sp1。通过凝胶迁移率试验(EMSA)发现:与不含G四链体结构的双链DNA和单链DNA相比，Sp1蛋白倾向结合含有G四链体结构的双链DNA和单链DNA。过表达或者敲减细胞内的细胞转录因子Sp1基因，荧光素酶报告基因试验发现，细胞转录因子Sp1对EP0基因的表达具有重要的调节作用。
最后我们检测小分子配体对PRV增值的影响。流式细胞仪分析发现小分子配体PDS和BRACO19主要抑制PRV生活周期中的复制阶段。在PRV HN-1201感染的细胞中加入PDS，发现PDS抑制立即早期基因IE180、早期基因EP0、TK以及毒力基因gB的表达，并且降低病毒滴度，具有抗病毒作用。
综上所述，EP0基因启动子的富含鸟嘌呤序列能够形成G四链体结构，该结构不仅对EP0启动子的活性具有负调控作用，而且影响细胞转录因子Sp1对其的识别和结合，小分子配体PDS能够稳定EP0启动子形成的G-四链体结构，并且抑制PRV在细胞内的复制。该研究首次从核酸结构的角度阐述调控EP0基因表达的分子机制，也为研究新型的抗PRV靶点提供理论基础。
通过生物信息学分析，我们发现EP0基因的启动子区域存在富含鸟嘌呤碱基的序列，该序列包含三个重叠的Sp1结合位点。圆二色光谱和凝胶电泳分析，发现该序列可以形成G四链体结构。硫酸二甲酯足迹保护试验和Taq聚合酶延伸阻滞试验表明，该序列的G四链体结构具有多态性。进一步利用FRET melting、凝胶电泳、以及Taq聚合酶延伸阻滞试验的方法，验证了小分子配体PDS可以诱导形成并且稳定G四链体结构。荧光素酶报告基因试验发现，G四链体结构对EP0启动子活性具有负调控作用。
EP0启动子区域中的Sp1结合位点的突变导致了其启动子活性的降低。为了探索该机制，接下来我们检测细胞转录因子Sp1对含有G四链体结构和不含G四链体结构DNA的识别和结合能力的差异。我们将Sp1基因与六种增加蛋白质可溶性的标签连接构建原核表达载体，并通过原核表达系统纯化目的蛋白，得到了纯度较高的融合蛋白MBP-Sp1。通过凝胶迁移率试验(EMSA)发现:与不含G四链体结构的双链DNA和单链DNA相比，Sp1蛋白倾向结合含有G四链体结构的双链DNA和单链DNA。过表达或者敲减细胞内的细胞转录因子Sp1基因，荧光素酶报告基因试验发现，细胞转录因子Sp1对EP0基因的表达具有重要的调节作用。
最后我们检测小分子配体对PRV增值的影响。流式细胞仪分析发现小分子配体PDS和BRACO19主要抑制PRV生活周期中的复制阶段。在PRV HN-1201感染的细胞中加入PDS，发现PDS抑制立即早期基因IE180、早期基因EP0、TK以及毒力基因gB的表达，并且降低病毒滴度，具有抗病毒作用。
综上所述，EP0基因启动子的富含鸟嘌呤序列能够形成G四链体结构，该结构不仅对EP0启动子的活性具有负调控作用，而且影响细胞转录因子Sp1对其的识别和结合，小分子配体PDS能够稳定EP0启动子形成的G-四链体结构，并且抑制PRV在细胞内的复制。该研究首次从核酸结构的角度阐述调控EP0基因表达的分子机制，也为研究新型的抗PRV靶点提供理论基础。