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第一,幽门螺杆菌CagA是目前已知的唯一注入胃粘膜细胞内的细胞毒力因子,导致胃粘膜上皮细胞紧密连接复合物破坏,可能与Hp致癌机制有关,但其信号转导机制尚未阐明。候选转录因子cdx2被确认在claudin-2侧翼调控区有特异的DNA结合位点,并调控其表达。本项目旨在获得cagA介导cdx2直接调控claudin-2表达的可靠证据,阐明CagA破坏胃粘膜细胞紧密连接复合物的信号转导通路,为进一步研究Hp致瘤分子机理提供科学依据。
方法:
以CagA野生型幽门螺杆菌菌株和CagA突变型幽门螺杆菌菌株(同基因突变体)为实验对照诱导体系,以间接免疫荧光法联合激光共聚焦荧光显微技术、RT-PCR、Real-timePCR、Westernblot方法、EMSA、电子显微镜、侵袭实验等为主要技术,研究幽门螺杆菌CagA介导cdx2调控claudin-2表达,导致细胞失接触、播散和高迁移生物学行为。
结果:
1.在CagA野生型幽门螺杆菌诱导下,AGS细胞Cdx2蛋白主要在细胞核表达,呈时间依赖性增强。
2.CagA野生型幽门螺杆菌介导Cdx2对claudin-2的调控
在CagA野生型幽门螺杆菌诱导下,AGS细胞Cdx2与claudin-2调控区CdxA(GTTTATG)和CdxB(TTTTAGG)两个位点结合能力明显增强。
在CagA野生型幽门螺杆菌诱导下,AGS细胞Cdx2在mRNA水平上调claudin-2呈时间依赖性表达。
在CagA野生型幽门螺杆菌诱导下,AGS细胞Cdx2在蛋白水平上调claudin-2呈时间依赖性表达。
3.CagA野生型幽门螺杆菌感染AGS细胞,AGS细胞紧密连接明显破坏,细胞间隙显著增宽,细胞表现为失接触、播散和高迁移的异常生物学行为。
结论:幽门螺杆菌CagA介导cdx2调控claudin-2表达,导致细胞失接触、播散和高迁移生物学行为,从而加速肿瘤的恶性演进。
第二,探讨cdx2和claudin-2蛋白相关表达在胃癌发生中的意义。
方法:
采用免疫组织化学ABC法在胃窦部病理组织蜡块中检测Cdx2和claudin-2的表达,其中,慢性浅表性胃炎108例,慢性萎缩性胃炎55例,肠型化生109例,不典型增生93例,肠型胃癌52例。
结果:
1.Cdx2蛋白主要表达于细胞核,在人体胃窦部粘膜慢性浅表性胃炎、慢性萎缩性胃炎、肠型化生、不典型增生和肠型胃癌组织中的表达率分别为0(0/108),0(0/55),91.67(99/108),52.81%(47/89),62.50%(30/48)。Cdx2在癌变多阶段组织中表达有逐渐增强的趋势(P<0.05);在肠型化生组织中表达呈“一过性”增强。
2.Claudin-2蛋白主要表达于细胞膜,在人体胃窦部粘膜慢性浅表性胃炎、慢性萎缩性胃炎、肠型化生、不典型增生和肠型胃癌组织中的表达率分别为0(0/108),0(0/55),0(0/109),35.87%(33/92),73.47%(36/49);Claudin-2在癌变多阶段组织中表达有逐渐增强的趋势(P<0.05)。
3.Cdx2和Claudin-2蛋白在人体胃癌癌变多阶段组织中表达显著相关(P<0.05)
结论:cdx2和claudin-2蛋白表达上调与胃癌的发生密切相关。