密旋链霉菌Act12是一株多效生防放线菌,已经被制备成商品化菌剂。全基因组测序表明,该菌株具有丰富的次级代谢产物生物合成基因簇。已有研究表明,链霉菌的次级代谢受到多层次的调控,如单组分信号调控系统和双组分信号调控系统。单组分信号系统中的一个重要家族―Tet R家族转录因子(Tet R family transcriptional regulators,TFRs),广泛调控各种生理过程,如抗生素的生物合成、药物外排、群体感应和初级代谢等。spa7074和spa0520是密旋链霉菌Act12中两个编码Tet R家族转录因子的基因,其缺失突变株MU7074和MU0520的发酵液中寡霉素的产量大大提高,对一些常见植物病原真菌的抑制作用明显增强。阐明Spa7074和Spa0520调控寡霉素生物合成的分子机制,有助于进一步代谢工程改造Act12菌剂,具有较好的理论意义和应用价值。现有的关于TFRs的调控机制研究表明,TFRs的配体具有多样性,其调控抗生素合成最直接的方式是与抗生素生物合成基因簇内的启动子区结合。因此本实验分析了Spa7074和Spa0520的序列特征和寡霉素生物合成基因簇的结构特征,构建了spa7074和spa0520的原核表达体系。通过体外结合实验―凝胶滞缓实验(EMSA)探究了Spa7074和Spa0520在基因簇内特异性结合的启动子序列。此外,对菌株Act12,缺失突变株MU7074和MU0520及spa7074的过表达菌株OE7074进行RNA-seq数据分析,进一步挖掘寡霉素生物合成的调控机制。主要取得以下几方面的研究成果:1.构建spa7074和spa0520的大肠杆菌表达体系,低温诱导表达、纯化,得到纯度较高且有活性的转录因子;2.利用anti SMASH对菌株Act12的全基因组进行预测,共获得了30个次级代谢产物基因簇。分析寡霉素生物合成基因簇,预测Spa7074和Spa0520可能结合的启动子序列,EMSA实验表明,Spa7074和Spa0520与寡霉素生物合成基因簇上可能的启动子序列未能表现出特异性结合的趋势,但Spa7074能与其自身的启动子区序列特异性结合,抑制寡霉素的生产;3.spa235基因编码环核苷酸结合域蛋白,其表达量在MU7074和MU0520中较Act12低,且Spa7074和Spa0520能够特异性的结合spa235的启动子序列,推测Spa7074和Spa0520通过调控Spa235的合成间接调控寡霉素合成;4.基于RNA-seq测序技术发现:在寡霉素合成基因簇上游有Tet R家族转录因子和ABC转运蛋白等,为后续进一步研究寡霉素生物合成的调控机制提供了新的思路和研究方向。