背景心肌梗死（myocardial infarction,MI）是在冠状动脉（冠脉）内皮发生损伤的基础上形成粥样斑块,随后斑块硬化堵塞管腔致使一支或多支冠脉管腔狭窄和心肌供血不足,而此时侧枝循环尚未充分建立,继而发生冠脉血流急剧减少或中断,使心肌出现严重而持久的缺血缺氧,最终引起心肌的缺血性坏死[1]。研究证实,多数急性MI是由于冠脉内斑块不稳定斑块破溃而产生的管腔内出血及血栓形成,最终堵塞管腔,少数是由于内部发生出血或是血管长时间痉挛最终引起血管闭塞[2-4]。临床症状多以心前区疼痛为主,伴有白细胞计数、血清心肌梗死标志物升高以及相应部位心电图（electrocardiogram,ECG）进行性改变等,严重者可发生心力衰竭（heart failure,HF）、休克和恶性心律失常等[5,6]。欧美国家MI的发病率较高,每年将近有150万MI患者,而其中约有80万MI患者会发生再次MI[7]。在我国,每年约百万人死于急性MI[8,9]。近年来,随着急诊药物溶栓的及时使用、冠脉介入手术及药物治疗的迅猛发展,MI患者死亡率呈逐年下降趋势[10]。然而,尽管大多数MI患者接受冠脉支架植入术（percutaneous coronary intervention,PCI）后预后较好,但部分患者仍会发生心室结构重构和电重构,此与MI患者发生不同程度HF及室性心律失常（ventricular arrhythmias,VAs）关系密切[11,12]。因此,如何改善MI患者的临床症状及预后,抑制MI后的结构重构和电重构,降低VAs发生率及相关机制研究仍是目前存在的主要问题。多项研究已证实,炎症反应在MI后心室结构重构和电重构的发生、发展中发挥重要作用,且在MI发病前、发病中及发病后的预后中血清炎性因子水平均发挥关键作用[13,14]。例如,白介素-6（interleukin 6,IL-6）是冠脉粥样硬化性心脏病（coronary heart disease,CHD）的重要危险炎性因子之一,MI患者的血清IL-6水平明显高于非CHD患者,相反,患者血清IL-6水平降低或是抑制血清IL-6水平可明显降低心血管事件发生率[15]。另有研究发现,白介素-4（interleukin 4,IL-4）可通过结合IL-4受体,引发下游信号级联反应,激活经典JAK-STAT6信号通路,最终发挥抑制MI后炎症反应,改善心室重构的作用[16]。此外,免疫应答在MI后心室重构中亦发挥着重要作用。巨噬细胞作为自身天然免疫系统的重要组成部分,是主要的炎症反应调控细胞之一,既可在MI后发挥吞噬坏死心肌细胞及其碎片、抑制炎症反应的作用,亦能够直接释放多种炎性因子而发挥促炎作用,加速MI后心室重构[17-19]。巨噬细胞多来源于外周循环血液中的单核细胞,随后进入心脏组织经过分化、迁移和增殖等,最终形成成熟的巨噬细胞,定居于心脏组织发挥特定功能。巨噬细胞在不同的免疫性疾病与细胞因子的作用下可呈现出不同的极化类型,目前根据其性质与功能主要分为两种:一为经典激活途径极化为M1型,高表达i NOS;二为替代极化途径极化为M2型,高表达Arg-1。其中,M1型巨噬细胞的主要作用为释放肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα,TNF-α）、IL-6等促炎因子,继而产生大量活性氮和氧中间体,促进免疫反应进程;M2型巨噬细胞则可分泌如白介素-10（Interleukin 10,IL-10）、转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）等抗炎性细胞因子,发挥免疫调节作用,且可以促进新生血管的再生及心肌组织重塑[20]。综上可知,巨噬细胞在MI后心脏的病理生理过程中是一把“双刃剑”,其在心脏结构重构和VAs的发生、发展中有着十分重要的作用。巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor,M-CSF）为损伤内皮细胞释放的一种多肽类激素样造血生长因子,能够促进造血祖细胞增殖、分化为单核巨噬细胞,并且能够在单核巨噬细胞的生长、增殖与分化过程中发挥重要作用,为炎症性疾病的敏感标志物[21]。因M-CSF具有促进巨噬细胞成熟的功能,对单核细胞具有化学趋化特性,其在MI的发生、发展中发挥重要作用。因此,本研究拟以小鼠为实验对象,制备MI模型后观察M-CSF及心脏巨噬细胞不同极化类型在MI后不同时间点心肌组织中的表达及意义,并通过给予MI小鼠腹腔注射M-CSF以探讨其通过调控心脏巨噬细胞对MI后心室结构重构和电重构中的影响及其相关机制,以期为临床治疗MI及改善其预后提供新的思路和实验依据。第一部分:M-CSF及巨噬细胞在心肌梗死后心肌组织中的表达及意义目的:探讨M-CSF及心脏巨噬细胞不同极化类型在MI后不同时间点心肌组织中的表达及其意义。方法:选择体重为20-25 g,8-10周龄的90只雄性C57BL/6J野生型（wild type,WT）小鼠,通过结扎冠脉左前降支（left anterior descending,LAD）制备MI模型。所有小鼠均行脾脏切除术（清除脾脏来源的干细胞以及骨髓干细胞进入脾脏）后恢复2周,随机均分为假手术组（Sham组,n=30）、MI后3天组（MI/3d,n=30）和MI后7天组（MI/7d,n=30）。Sham组给予结扎线穿过LAD不结扎,MI/3d组和MI/7d组均行结扎LAD制备MI模型,并于MI后3天和7天时处死小鼠取材。RT-PCR法及Western-blot法检测M-CSF在3组小鼠心肌组织中的表达情况。免疫荧光法检测MI后心肌组织中M1型、M2型巨噬细胞的表达情况。Western-blot法检测MI后心肌组织中NF-κB/STAT信号通路相关蛋白的表达水平。结果:与Sham组比较,RT-PCR与Western-blot法检测结果均显示MI/3d组和MI/7d组的M-CSF均明显升高,且MI/3d组的M-CSF表达水平显著高于MI/7d组（均P<0.05）。免疫荧光法检测结果显示,M1型巨噬细胞于MI后3天时表达明显升高（P<0.05）,随后其增长趋势逐渐下降,而M2型巨噬细胞于MI后3天表达明显升高,于MI后7天时表达水平亦显著高于3天时,且M2型巨噬细胞于MI后3天时仍明显低于M1型巨噬细胞（P<0.05）,至MI后7天时则明显较M1型巨噬细胞高（P<0.05）。Western-blot法检测结果显示NF-κB p65、STAT3和STAT6于MI/3d组表达显著高于MI/7d组,同时两组亦明显高于Sham组（均P<0.05）。结论:MI后心肌组织中M-CSF、NF-κB p65、STAT3和STAT6于MI急性期表达均显著升高,M2型巨噬细胞于MI后持续升高,而M1型巨噬细胞于MI后急性期显著升高,随后其增长趋势逐渐下降,由此我们推测M-CSF、巨噬细胞及NF-κB/STAT信号通路在小鼠MI后心室重构中发挥了重要作用。第二部分:M-CSF通过调控心脏巨噬细胞对小鼠心肌梗死后炎症反应及心肌细胞凋亡的影响及其机制目的:探讨M-CSF通过调控心脏巨噬细胞对小鼠MI后炎症反应及细胞凋亡的影响及其相关机制。方法:选择体重为20-25 g,8-10周龄的110只雄性C57BL/6J WT型小鼠,所有小鼠行脾脏切除术后恢复2周,通过结扎LAD建立MI模型。实验动物分为3组,WT型小鼠假手术组给予结扎线穿过LAD不结扎（Sham组,n=30）,结扎LAD制备MI模型后于术后第1天始给予腹腔注射M-CSF试剂（500 ug/kg/d）连续5天（MM组,n=40）及腹腔注射同等液体量生理盐水连续5天（MC组,n=40）。3组小鼠均于屏障环境中常规饲养1周。实验结束时眼球采集静脉血,处死小鼠取心脏组织。免疫荧光法检测3组小鼠M1型、M2型巨噬细胞的表达水平;ELISA法检测血清及心脏组织中IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、单核细胞趋化因子1（monocyte chemotactic protein-1,MCP-1）以及干扰素α（interferonα,IFN-α）水平;Western-blot法检测3组小鼠心肌组织中NF-κB/STAT信号通路相关蛋白--NF-κB p65、STAT3和STAT6的表达水平及细胞凋亡相关蛋白水平--Bax、Caspase 3、C-Casp 3、Bcl-2的水平。TUNEL染色观察3组小鼠心肌细胞凋亡情况。结果:免疫荧光检测3组小鼠心肌组织中M1型和M2型巨噬细胞的结果显示,MC组中M1型巨噬细胞的表达水平明显高于Sham组与MM组（均P<0.05）,且MM组M1型巨噬细胞亦高于Sham组,但差异无统计学意义（P>0.05）;与Sham组和MC组相比,MM组中M2型巨噬细胞的表达水平明显升高（均P<0.05）,同时,MC组中M2型巨噬细胞的表达水平亦高于Sham组,但差异无统计学意义（P>0.05）。ELISA法结果显示,MC组和MM组小鼠血清及组织中IL-6与TNF-α水平均较Sham组明显升高（均P<0.05）;与MC组比较,MM组血清及心肌组织中TNF-α与IL-6水平显著降低（均P<0.05）;与此相反,MC组血清及心肌组织中IL-4与IL-10的表达水平均显著低于MM组,且MC组血清中IFN-α亦明显较MM组低（均P<0.05）。Western-blot结果显示,MC组与MM组MI小鼠一周后心肌组织中NF-κB p65、STAT3与STAT6的表达水平均显著高于Sham组,且MM组小鼠STAT3与STAT6的水平亦明显高于MC组（均P<0.05）;在MM组与MC组小鼠心肌组织中,梗死周边区的STAT6表达水平较非梗死区高（P<0.05）。TUNEL染色结果显示,MC组和MM组小鼠的心肌细胞凋亡率显著高于Sham组（均P<0.05）;与MC组相比,MM组小鼠的心肌凋亡率则明显下降（P<0.05）。Western-blot法检测3组小鼠凋亡相关蛋白结果显示,MC组小鼠心肌组织中Bax、Caspase 3与C-Casp 3的表达水平均较Sham组明显升高,而抗凋亡蛋白Bcl-2水平则明显降低（均P<0.05）;与MC组比较,MM组小鼠中Bax、Caspase 3与C-Casp 3水平明显降低（均P<0.05）,而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平则明显增加（P<0.05）。结论:M-CSF可明显增加M2型巨噬细胞的表达、抑制M1型巨噬细胞水平的升高,继而发挥抑制小鼠MI后炎症反应、减轻心肌细胞凋亡的情况,NF-κB/STAT信号通路在此过程中发挥重要作用。第三部分:M-CSF通过调控心脏巨噬细胞对小鼠心肌梗死后心室结构重构的影响及其机制目的:探讨M-CSF通过调控小鼠心脏巨噬细胞对MI后心室结构重构的影响及其相关机制。方法:选择体重为20-25 g,8-10周龄的110只雄性C57BL/6J WT型小鼠,所有小鼠行脾脏切除术后恢复2周,通过结扎LAD制备MI模型。实验动物分为3组,WT型小鼠假手术组给予结扎线穿过LAD不结扎（Sham组,n=30）,结扎LAD制备MI模型后于术后第1天给予腹腔注射M-CSF试剂（500 ug/kg/d）连续5天（MM组,n=40）以及腹腔注射同等液体量生理盐水连续5天（MC组,n=40）。3组小鼠均于屏障环境中饲养1周。模型制备成功后每天观察3组小鼠的生存状态,统计死亡数量,于实验终点绘制生存曲线。超声心动图评价3组小鼠实验结束时的心脏功能。测定小鼠体重（body weight,BW）、心脏重量（heart weight,HW）、肺脏重量（lung weight,LW）以及胫骨长度（tibia length,TL）。HE染色观察3组小鼠心肌梗死面积。天狼星红染色观察3组小鼠心肌间质胶原沉积情况。ELISA法检测3组小鼠梗死周边区心肌组织中心肌肥大相关指标:心钠肽（atrial natriuretic peptide,ANP）、脑钠肽（brain natriuretic peptide,BNP）和β肌球蛋白重链（β-myosin heavy chain,β-MHC）以及纤维化相关指标（Collage I、Collage III）。免疫组化法测定3组小鼠MI周边区新生血管标志物CD31的表达情况。结果:与Sham组比较,MC组和MM组小鼠MI后的生存率明显下降,且MC组小鼠的生存率显著低于MM组。心脏超声心动图结果显示,与Sham组比较,MC组和MM组小鼠于MI一周后心脏功能明显下降,左心室舒张末期内径（left ventricular end-diastolic diamention,LVEDd）、左心室收缩末期内径（left ventricular end-systolic diamention,LVSDd）、左心室舒张末期后壁厚度（left ventricular end-diastolic posterior wall,LVPWd）、左心室收缩末期后壁厚度（left ventricular end-systolic posterior wall,LVPWs）、收缩期室间隔厚度（systolic interventricular septum,IVSs）以及舒张末期室间隔厚度（diastolic interventricular septum,IVSd）均明显增加（均P<0.05）,且两组小鼠的短轴缩短率（Fractional shorting,FS）以及左室射血分数（Left ventricular ejection fraction,LVEF）明显降低（均P<0.05）。与MC组小鼠比较,MM组小鼠的心室功能明显改善,LVEDd、LVSDd、LVPWd、LVPWs、IVSs以及IVSd均明显降低,且FS与LVEF均较MC组显著增加（均P<0.05）。HE染色观察3组小鼠心肌梗死面积结果显示,MM组小鼠MI于一周后心肌梗死面积明显低于MC组小鼠（P<0.05）。与Sham组相比,天狼星红染色结果显示,MC组小鼠心肌组织中胶原沉积情况明显增加,而MM组小鼠则显著低于MC组（均P<0.05）。与Sham组比较,MC组小鼠心肌组织中ANP、BNP及β-MHC水平均明显升高（均P<0.05）,而MM组小鼠则显著低于MC组（均P<0.05）。ELISA法检测心肌相关纤维化指标结果显示,MC组小鼠心肌组织中Collage I、collage III表达水平显著高于Sham组,而MM组Collage、collage III表达水平则明显低于MC组（均P<0.05）。免疫组化法检测3组小鼠梗死周边区新生血管标记物CD31的表达情况结果显示,与MC组相比,MM组小鼠梗死周边区CD31表达水平明显升高（P<0.05）。结论:M-CSF通过调控心脏巨噬细胞参与小鼠MI后心室的结构重构,可显著提高小鼠MI后的生存率,改善小鼠心脏功能及心室射血分数,减轻小鼠梗死面积,促进新生血管的再生,同时可减轻心肌细胞肥大及心肌纤维化。第四部分:M-CSF通过调控心脏巨噬细胞对小鼠心肌梗死后心室电重构的影响及其机制目的:观察M-CSF通过对心脏巨噬细胞的调控作用对小鼠心肌梗死后心室电重构的影响及其相关机制。方法:选取体重为20-25 g,8-10周龄的雄性C57BL/6 WT型小鼠110只,所有小鼠行脾脏切除术后恢复2周,通过结扎LAD建立MI模型。实验动物分为3组,WT型小鼠假手术组给予结扎线穿过LAD不结扎（Sham组,n=30）,结扎LAD制备MI模型后于术后第1天始给予腹腔注射M-CSF试剂（500 ug/kg/d）连续5天（MM组,n=40）及腹腔注射同等液体量生理盐水连续5天（MC组,n=40）。3组小鼠均于屏障环境中饲养1周。实验结束后,采用Langendorff离体电生理监测技术,记录小鼠MI后ECG情况,对3组小鼠离体心脏给予S1S2程控刺激检测心室有效不应期（effective refractory period,ERP）,采用S1S1程控刺激检测动作电位时程（action potential duration,APD）、动作电位电交替阈值及各种VAs诱发情况。免疫荧光法测定3组小鼠MI周边区心肌组织中酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase,TH）的表达水平。Western-blot法检测3组小鼠MI周边区缝隙连接蛋白43（connexin 43,Cx43）的表达情况。结果:小鼠离体心脏ECG结果显示,3组小鼠间的PR间期、RR间期无明显差异（均P>0.05）;但与Sham组比较,MC组与MM组的QRS间期、QT间期及矫正QT间期（QTc）均明显延长,且MM组上述指标较MC组均明显缩短（均P<0.05）。ERP结果显示,与Sham组比较,MC组和MM组小鼠梗死周边区ERP均明显缩短,且MM组较MC组明显延长（均P<0.05）。与Sham组相比,MC组与MM组小鼠的APD90明显延长,且MM组较MC组明显缩短（均P<0.05）;3组小鼠的动作电位电交替诱发阈值结果显示,MC组与MM组小鼠的动作电位电交替诱发阈值均显著低于Sham组（均P<0.05）,且MM组较MC组明显升高（P<0.05）。与Sham组相比,MC组VAs诱发率明显增加（P<0.05）,而MM组VAs的诱发率则较MC组明显降低（P<0.05）。3组小鼠梗死周边区心肌组织中TH的表达情况结果显示,与Sham组相比,MC组与MM组的TH水平均显著增加,而MC组的TH水平明显高于MM组（均P<0.05）。Western-blot法测定3组小鼠Cx43的表达结果发现,与Sham组比较,MC组Cx43的水平降低明显（P<0.05）,而MM组小鼠Cx43的表达水平则明显高于MC组（P<0.05）。结论:M-CSF通过调控心脏巨噬细胞可明显延长MI后心室ERP、降低VAs诱发率,可能与其能够抑制交感神经超分布、抑制Cx43的降解、减轻心肌细胞的解偶联有关。