研究目的心室重构是指心室受到损伤时发生的结构和功能的改变,出现心肌细胞肥大、死亡、间质纤维化、心肌肥厚、心肌细胞膜离子通道、交感神经支配的变化等。许多心血管疾病如高血压、心肌梗死、心力衰竭、扩张型心肌病、心脏瓣膜病等都存在心室重构现象,另外在高同型半胱氨酸血症、动脉粥样硬化、糖尿病等其他疾病并发症中也存在心室重构现象。心室重构是多种因素共同作用所产生的形态学、分子生物学、病理生理学、电生理环境的变化,其机制主要包括炎症反应、血流动力学负荷、细胞因子生成和蛋白酶诱导的细胞外基质(extracellular matrix, ECM)降解。NOD样受体(NOD-like receptor, NLRs)是一类新型胞浆内的固有免疫模式识别受体,识别细胞内病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)或内源性危险信号相关分子(dangers-associated molecular patterns, DAMPs),从而启动免疫应答,在自身免疫调节中起重要作用。到目前为止,共发现了22个NLR家族成员,其中最具代表性的是NOD1(nucleotide-binding oligomerization domain containing1)和NOD2(nucleotide-binding oligomerization domain containing2).有文献报道,NOD1激动剂iEDAP注射小鼠心脏,激活NF-κB (nuclear transcription factor κB)和TGF-β (transforming growth factor β)信号通路,诱导心肌细胞坏死和凋亡进而导致心脏功能异常。但有关NOD2在心脏中表达及在心室重构中的作用,迄今尚未见报道。为此,本课题选用高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia, hHcys)及心肌梗死(myocardial Infarction, MI)两种不同程度的心室重构模型,探讨NOD2是否参与心室重构过程,并就NOD2调节心室重构过程的可能机制进行深入研究。研究方法第一部分：通过无叶酸饮食建立WT和CBS+/-小鼠高同型半胱氨酸血症模型,利用小动物超声心动图检测小鼠左心室内径及心功能,Western Blot、RT-PCR和免疫组化等方法检测NOD2在心肌组织中的表达情况。体外实验用不同浓度的L-Hcy刺激大鼠心肌细胞H9C2和平滑肌细胞(smooth muscle cell,SMC),Western Blot方法检测NOD2的蛋白表达水平。为探讨NOD2在高同型半胱氨酸血症心室重构中的机制,我们采用NOD2敲基因鼠建立高同型半胱氨酸血症模型,进一步利用小动物超声心动图检测小鼠左心室内径及心功能指标,观察NOD2对hHcys引起心室重构的影响；Masson染色观察小鼠纤维化程度；通过Western Blot方法检测心室重构标志物基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase2,MMP-2)、基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase9,MMP-9)及基质金属蛋白酶抑制剂1(tissue inhibitor of metalloproteinase1,TIMP-1)等指标的表达变化。第二部分：通过永久性结扎冠状动脉左前降支建立小鼠心肌梗死模型。在心梗后3、7、14和28天分别收集梗死区和非梗死区的心肌组织,用实时荧光定量PCR检测不同梗死时间后NOD2的mRNA表达水平,通过免疫组化染色和、Western Blot分析心梗NOD2的蛋白表达水平。为进一步明确NOD2在心梗左室重构中的作用,采用NOD2敲基因小鼠建立心肌梗死模型,小动物超声心动图检测心肌梗死的小鼠左心室内径及心功能。通过Masson和Tunel染色观察野生和NOD2-/-小鼠心梗后纤维化程度及细胞调亡情况,酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定组织的促炎细胞因子水平,心肌组织裂解液运用Western Blot和明胶酶谱法检测MMP9、MMP2蛋白及活性变化,并用免疫组化染色观察心梗后炎性细胞浸润和心脏成纤维细胞(cardiac fibroblast,CF)转分化成心肌成纤维细胞情况。体外实验采用小鼠原代成纤维细胞探讨NOD2参与心室重构的分子机制,运用Western Blot等方法测定胞壁酰二肽(Muramyl Dipeptide,MDP)刺激成纤维细胞所产生的p38、细胞外信号调节激酶(Extracellular regulated proteinkinases1/2,ERK1/2)磷酸化水平及成纤维细胞缺氧4h复氧不同时间后NOD2和MMP9蛋白表达水平；ELISA检测MDP刺激成纤维细胞及成纤维细胞转染后缺氧4h复氧24h产生的炎性因子变化水平。结果第一部分：①NOD2随着血浆Hcy浓度的升高蛋白表达增加,在CBS+/-模型组中表达最强,其次是WT模型组。免疫组化和PCR结果同样证实,NOD2在CBS+/-模型组中的表达最强。②利用不同浓度的L-Hcy刺激大鼠心肌细胞H9C2,发现NOD2的表达成浓度依赖性上调,其中,L-Hcy浓度在25μmol/L时,NOD2表达最强；不同浓度的L-Hcy刺激SMC, NOD2的表达同样显著上调。③心室重构标志物MMP9在WT模型中表达显著升高,NOD2敲除后MMP9表达降低；COL1在WT模型中表达降低,而NOD2敲除后COL1表达升高。虽然NOD2能影响MMP9、 C0L1的蛋白表达,但是NOD2缺失未能减轻hHcys引起的心室重构。相比于WT对照组,WT模型组的左室舒张末期内径(LVIDd),左室收缩末期内径(LVIDs)增大,说明左室肥大；左室舒张末期后壁厚度(LVPWd)和左室收缩末期后壁厚度(LVPWs)降低则表明左室壁变薄。而NOD2敲基因鼠高同型半胱氨酸血症后的左室肥大和室壁变薄现象并没有改变,说明NOD2基因敲出后未能减轻hHcys引起的心室重构。第二部分：①首次证实,NOD2在心梗组织中表达升高。与假手术组相比,MI组非梗死区和梗死区NOD2mRNA表达水平明显升高,其中梗死区NOD2的mRNA表达变化水平最高,而且呈时间依赖性变化；Western Blot和免疫组化结果同样证实了心梗后NOD2表达升高。②NOD2缺失能减轻心梗后心肌功能失常和心肌重构的发生。通过超声心动图发现,NOD2-/-,心梗组心功能损伤明显改善；WT心梗后变化的左室直径和室壁厚度在NOD2"/-敲基因鼠模型中也有所减轻,心肌重构减弱；TUNEL和Masson染色显示在NOD2-/-心梗组,细胞凋亡和心肌纤维化程度明显降低。③我们进一步发现,NOD2缺失能降低心梗区炎性因子水平,炎性细胞的浸润及MMP-9的活性。心梗发生后,TGF-β、白介素1β(interleukin,IL-1p)、肿瘤坏死因子α(Tumor Necrosis Factor,TNF-α)、单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemoattractant protein, MCP-1)等炎性因子水平显著升高,而NOD2缺失能降低这些炎性因子的水平。小鼠心肌梗死后MMP9的蛋白和活性都升高, NOD2缺失后减弱了MI导致的MMP9蛋白和活性水平的提高。炎性细胞浸润在NOD2-/-心梗组中表达也显著降低。④MDP诱导心肌成纤维细胞有丝分裂原激活蛋白激酶(Mitogenaetivated proteinkinase, MAPK)信号通路的激活和促进促炎介质的产生。我们利用NOD2激活剂MDP刺激心肌成纤维细胞,发现P38、ERK-1/2等激酶的磷酸化水平增加；IL-1β、TNF-α、TGF-β、MCP-1、IL-8、细胞间黏附因子1(Intercellular adhesion molecule,ICAM-1)等促炎介质表达水平显著升高。⑤NOD2沉默减弱缺氧诱导的MMP9表达。在原代培养的心肌成纤维细胞中,缺氧／复氧显著增加NOD2和MMP9的表达,NOD2基因沉默后,缺氧诱导的MMP9表达和促炎介质的表达受到抑制。结论1.本文首次探讨了NOD2在高同型半胱氨酸血症(hHcys)导致心室重构中的作用,发现NOD2在CBS+/-造模的hHcys小鼠心肌组织中蛋白及mRNA水平显著升高；利用NOD2敲基因鼠进一步研究发现, NOD2缺失虽能降低心室重构标志物MMP9的表达,但对高同型半胱氨酸血症诱导的心室重构没有改善作用。分析原因一是高同型半胱氨酸血症对心脏的损伤较小,只影响左室舒张内径和左室后壁厚度而对心脏收缩及舒张功能没有影响,因此NOD2缺失后的改善作用未能体现出来。二是NOD2敲除后可能衍生出别的代偿机制从而影响高同型半胱氨酸血症引起的心脏损伤,具体机制需进一步明确。2.建立冠状动脉左前降支结扎心肌梗死模型,研究NOD2是否参与心肌梗死导致的心室重构过程。我们证实,在心肌梗死区和非梗死区NOD2mRNA表达水平明显升高,其中梗死区NOD2的mRNA表达变化水平最高。利用NOD2敲基因鼠进一步研究发现,NOD2缺失能减轻心梗后心功能障碍和心肌重构的发生,细胞凋亡和心肌纤维化程度也明显降低。研究表明,NOD2通过调控MMP9蛋白及活性、炎性介质水平和炎性细胞浸润来介导心肌梗死后左室重构过程。体外采用小鼠心脏原代成纤维细胞,研究表明MDP诱导激活了心肌成纤维细胞MAPK通路,p38,ERK1/2磷酸化水平升高,并且释放大量炎性介质；心肌成纤维细胞缺氧再灌注NOD2和MMP-9水平明显升高,而NOD2基因沉默后,缺氧诱导的MMP9蛋白表达及炎性介质水平明显降低。