研究背景急性冠脉综合征（Acute coronary syndrome,ACS）,包括急性心肌梗死和不稳定性心绞痛,是急诊医学领域的常见高危疾病,也是动脉粥样硬化性心血管疾病的主要死因。多年来,药物、介入治疗和外科手术取得了一系列重要进展,大大降低了 ACS患者的死亡率,改善了预后,但每年仍有1900万人死于冠状动脉疾病。因此,减少ACS的发病率,仍是急危重心血管病领域亟待攻关的重要难题。而对高危患者进行早期识别,进行精准防治,是解决这一难题的重要切入点。冠状动脉粥样硬化斑块破裂或侵蚀（即易损斑块）是ACS的病理基础,易损斑块的特点之一是增大的坏死核心,近年来,越来越多的研究表明,胞葬作用下降是动脉粥样硬化斑块坏死核心增大的主要驱动因素。胞葬（Efferocytosis）是指由专职和非专职吞噬细胞清除凋亡细胞碎屑的过程,机体通过胞葬作用,有效清除凋亡细胞,防止凋亡细胞继发坏死,减少促炎介质的释放,维持组织和器官稳态。凋亡细胞碎屑累积导致斑块增大和斑块易损性增加,而巨噬细胞吞噬（胞葬作）凋亡细胞碎屑可抑制这一病变过程。近年来研究发现,胞葬作用减弱是动脉粥样硬化坏死核心形成的主要驱动因素,可引发斑块破裂和急性血栓性心血管事件。因此,维持胞葬作用的正常水平以高效地清除凋亡细胞对预防动脉粥样硬化斑块的发展起着关键作用。临床研究表明,乙醛脱氢酶2（ALDH2）基因突变导致ACS发病风险增加近2倍,且显著增加ACS不良预后发生率。ALDH2是人体内酒精（乙醇）代谢和多种内外源性毒性醛类物质代谢的关键酶。人类线粒体ALDH2蛋白由ALDH2基因编码,广泛分布于人体各器官组织中,以肝脏最为丰富,同时也大量存在于其他需要消耗大量ATP的器官,如心脏和大脑。位于第12外显子的ALDH2的Glu504Lys多态性位点（rs671）广泛存在于中、日、韩等东亚人群,突变率高达30%-50%,而在欧美白种人中罕见。该ALDH2基因多态与许多疾病密切相关,如酒精相关性疾病（肝炎、肝硬化等）、肺动脉高压、心肌梗死、脑卒中等。探究动脉粥样硬化斑块（特别是易损斑块）形成的病理生理机制,寻找潜在治疗靶点,对于实现ACS患者精准防治、进一步降低其发病率及改善其预后具有重要的临床价值和社会意义。临床研究结果提示,ALDH2可能是实现国人ACS患者精准防治的重要突破点,且鉴于ALDH2 rs671突变在我国的高携带率,探明ALDH2 rs671基因突变增加ACS发生率和不良预后的机制,对于我国30%-50%的突变人群尤其重要。为了进一步明确ALDH2调控动脉粥样硬化进展的具体机制,我们设计进行了该实验课题。研究目的1.明确巨噬细胞ALDH2基因缺陷对动脉粥样硬化进展的影响2.明确巨噬细胞ALDH2基因缺陷对胞葬作用的影响3.探究ALDH2如何调控巨噬细胞胞葬作用研究方法我们通过骨髓移植的方法构建APOE-/-背景下髓系细胞ALDH2基因敲除小鼠,高脂喂养8周进行动脉粥样硬化模型构建,探究髓系细胞ALDH2基因敲除对动脉粥样硬化斑块面积和坏死核心大小的影响,并通过免疫荧光染色等方法检测在体胞葬作用和细胞凋亡水平,确定坏死核心增加的原因。通过提取ALDH2-/-小鼠原代腹腔巨噬细胞和骨髓诱导的巨噬细胞,通过流式细胞术检测胞葬作用,并通过RNA-seq和蛋白质谱分析筛选ALDH2影响的下游胞葬相关蛋白。然后使用HEK293T细胞转染外源性质粒,运用多种生物学技术,深入探究ALDH2对下游胞葬相关蛋白的调控机制。（一）动物实验1.动物实验方案构建髓系细胞ALDH2基因敲除小鼠:将6-8周龄APOE-/-小鼠随机分为2组,分为APOE-/-髓系细胞受体组和APOE-/-ALDH2-/-髓系细胞受体组,利用X射线生物辐照仪对两组小鼠进行致死性辐射剂量（8.5Gy）照射,清除其原有骨髓。随后提取6-8周龄APOE-/-小鼠和APOE-/-ALDH2-/-小鼠骨髓细胞,通过尾静脉注射方式进行骨髓移植。骨髓移植15天后提取小鼠原代腹腔巨噬细胞检测ALDH2蛋白含量,验证骨髓移植效率。2.小鼠动脉粥样硬化模型建立小鼠骨髓移植并恢复性喂养4周后,改为高脂高胆固醇喂养8周,模型构建结束后对小鼠进行取材,收集小鼠血清、主动脉和心脏,以待后续检测。3.主动脉大体染色动脉粥样硬化斑块面积检测对小鼠主动脉进行大体油红O染色,油红O着色处为斑块区域,以大体染色斑块面积与主动脉面积的比值作为大体斑块面积指标。4.主动脉根部切片动脉粥样硬化斑块面积和斑块内容物检测心脏取材后,对主动脉根部进行连续冰冻切片,对切片进行HE染色、油红O染色、α-SMA染色、MOMA-2染色和天狼星红染色,以HE染色结果中斑块面积与心腔面积的比值作为动脉粥样硬化斑块面积指标,以各染色结果中阳性区域面积与斑块面积的比值作为斑块内容物的面积指标。5.小鼠动脉粥样硬化斑块区域凋亡细胞含量和体内胞葬能力检测心脏取材后,对小鼠主动脉根部冰冻切片进行TUNEL染色标记凋亡细胞,以及MOMA-2免疫荧光染色标记巨噬细胞,以TUNEL染色斑块平均荧光光密度作为凋亡细胞含量指标,以与巨噬细胞共定位的凋亡细胞和游离凋亡细胞的比值作为胞葬能力指标。6.小鼠血脂含量测定小鼠取材时,以心尖取血的方式留取小鼠血液,将血液在4℃以2500g离心15分钟,收集血清使用相应的试剂盒,检测血清胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白含量。7.统计分析计量资料数据符合正态分布且方差齐时,采用均数±标准误（Means±SEM）表示,并使用t检验统计,不符合正态分布或符合正态分布但方差不齐时,采用中位数（第二四分位数,第三四分位数）表示,并使用Mann-Whitney检验,应用GraphPad Prism 8软件对数据进行统计学分析,包括正态分布检验、方差齐性检验、t检验和Mann-Whitney检验等,P＜0.05被视为具有统计学差异。（二）细胞实验1.细胞实验方案为了探究ALDH2基因敲除能否抑制巨噬细胞体外胞葬作用,我们提取小鼠原代腹腔巨噬细胞和骨髓诱导的巨噬细胞,与诱导凋亡的平滑肌细胞共培养,流式细胞术检测胞葬作用。为了探究ALDH2基因敲除影响的下游胞葬相关基因,我们收集凋亡细胞刺激后的原代腹腔巨噬细胞,进行RNA-seq和蛋白质组学检测,并进行生物信息学分析,筛选出了 ALDH2影响的胞葬下游蛋白Rac2。随后分别提取野生型小鼠原代腹腔巨噬细胞和ALDH2-/-小鼠原代腹腔巨噬细胞,添加凋亡细胞刺激后检测下游胞葬相关蛋白Rac2的表达。为进一步探究ALDH2如何调控下游胞葬相关蛋白Rac2,我们构建了 ALDH2野生型质粒、ALDH2rs671突变型质粒和Rac2质粒,通过免疫共沉淀检测ALDH2野生型或ALDH2突变型与Rac2的结合作用。随后利用泛素化结合实验,探究ALDH2调控Rac2蛋白的具体作用机制。2.原代腹腔巨噬细胞提取小鼠腹腔注射淀粉肉汤,3天后脱颈处死小鼠,使用10ml无菌注射器吸取无血清高糖DMEM培养基,冲洗小鼠腹腔,收集冲洗液,4℃离心800rpm离心5分钟后收集沉淀,用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基培养。3.骨髓诱导的巨噬细胞提取取8周龄小鼠,脱颈处死后,分离小鼠股骨和胫骨,PBS冲洗出髓腔内骨髓细胞,使用细胞筛网去除碎骨,4℃1500g离心15分钟后,重悬沉淀,使用含25ng/ml小鼠M-CSF、1 0%胎牛血清的高糖DMEM培养基培养7天,诱导巨噬细胞分化。4.胞葬能力检测使用星胞菌素诱导平滑肌细胞凋亡,将凋亡的平滑肌细胞收集后细胞计数,按照凋亡细胞:巨噬细胞=1:1的比例将凋亡细胞和巨噬细胞共培养1.5小时,利用流式细胞术检测胞葬能力。5.HEK293T细胞质粒转染使用lipo 2000作为助转染试剂,将对应质粒转染入HEK293T细胞中。6.蛋白表达检测用原代巨噬细胞提取蛋白后,使用10%-15%SDS-PAGE电泳进行分离、转膜、一抗/二抗孵育后进行检测。7.mRNA表达检测提取原代巨噬细胞中mRNA,通过RT-qPCR进行检测。8.统计分析同动物实验步骤。研究结果1.髓系细胞ALDH2基因敲除促进动脉粥样硬化进展利用骨髓移植的方式构建APOE-/-背景下髓系细胞ALDH2基因敲除小鼠,高脂喂养8周后,结果显示髓系细胞ALDH2基因敲除在不影响血脂的情况下,显著增加动脉粥样硬化斑块面积,增加斑块巨噬细胞浸润和脂质沉积,增加坏死核心面积,减少胶原纤维含量,但不影响平滑肌细胞含量。2.巨噬细胞中ALDH2基因敲除抑制体内体外胞葬作用TUNEL染色和TUNEL+MOMA-2双染结果发现,髓系细胞ALDH2基因敲除不影响斑块内凋亡细胞总量,但显著降低斑块内巨噬细胞胞葬能力。提取原代巨噬细胞和BMDM进行体外胞葬实验,发现ALDH2基因敲除显著抑制巨噬细胞胞葬能力。3.ALDH2基因敲除抑制下游胞葬相关基因Rac2的表达将凋亡细胞刺激后的巨噬细胞收集送mRNA测序,生物信息学分析结果显示ALDH2基因敲除抑制胞葬相关通路基因的表达。将测序结果同GEO数据库中单细胞测序结果进行联合分析,发现在ALDH2调控的胞葬相关基因中,Rac2基因表达在胞葬中上调最明显。同时收集凋亡细胞刺激后的巨噬细胞的蛋白,利用ALDH2抗体富集与ALDH2结合的蛋白进行蛋白质谱分析,结果显示ALDH2蛋白能够和Rac2蛋白结合。随后的验证实验进一步证实,ALDH2基因敲除降低Rac2基因的mRNA和蛋白表达水平。4.ALDH2基因敲除通过影响Rac2抑制巨噬细胞胞葬作用通过siRNA抑制巨噬细胞中Rac2表达,可以显著抑制原代腹腔巨噬细胞和骨髓诱导的巨噬细胞胞葬能力。在ALDH2基因敲除骨髓诱导的巨噬细胞中,利用腺病毒过表达Rac2蛋白表达,可以显著挽救其受损的胞葬能力。5.ALDH2蛋白可以和Rac2蛋白直接结合利用共聚焦显微镜,在原代巨噬细胞中对ALDH2和Rac2蛋白进行荧光双染,结果显示ALDH2蛋白和Rac2蛋白有明显的共定位现象。将ALDH2-WT质粒、ALDH2-rs671质粒和Rac2质粒转染入HEK293T细胞中,通过蛋白免疫共沉淀实验,发现ALDH2蛋白可以和Rac2蛋白结合。利用体外翻译系统,体外表达ALDH2-WT蛋白、ALDH2-rs671蛋白和Rac2蛋白,并进行体外结合实验,发现ALDH2-WT蛋白和ALDH2-rs671蛋白均能够通过直接结合的方式和Rac2蛋白结合。通过构建Rac2截断体,外源结合实验显示ALDH2蛋白和Rac2蛋白的结合区域在Rac2蛋白的1-136氨基酸肽段内。6.ALDH2蛋白抑制Rac2蛋白泛素化并稳定Rac2蛋白提取小鼠腹腔巨噬细胞,添加蛋白合成酶抑制剂CHX,抑制蛋白合成后检测Rac2蛋白的降解。结果显示,和野生巨噬细胞相比,ALDH2基因敲除巨噬细胞中Rac2蛋白降解速率显著增加。在ALDH2基因敲除巨噬细胞中回补ALDH2-WT和ALDH2-rs671,发现回补ALDH2-WT可以挽救Rac2蛋白的降解,而回补ALDH2-rs671无法挽救Rac2蛋白的降解。分别给予ALDH2野生组巨噬细胞和ALDH2基因敲除组巨噬细胞CHX刺激和MG-132或氯喹刺激,检测Rac2蛋白的降解,结果显示,在两组中,添加MG-132抑制蛋白酶体降解途径显著抑制Rac2降解,而添加氯喹抑制溶酶体降解途径无法抑制Rac2降解,说明Rac2降解主要通过蛋白酶体途径。随后将ALDH2-WT质粒与ALDH2-rs671质粒分别和泛素化质粒与Rac2质粒共转染入HEK293T细胞中,免疫共沉淀结果显示,和ALDH2-WT相比,ALDH2-rs671突变或者ALDH2基因缺乏显著增加Rac2蛋白泛素化。随后我们构建了 Rac2蛋白上赖氨酸位点单氨基酸突变,将其与泛素化质粒、ALDH2质粒共转染入HEK293T细胞中,发现ALDH2调控的Rac2泛素化位点位于第123位赖氨酸,同时通过泛素化结合实验,发现ALDH2调控的Rac2泛素化形式是K48连接的泛素化。7.人巨噬细胞中ALDH2 rs671突变抑制胞葬作用中Rac2的上调,进而抑制其胞葬作用通过提取人单核巨噬细胞,添加凋亡Jurkat细胞刺激,发现和ALDH2-WT相比,ALDH2-rs671不影响基线状态下Rac2蛋白表达,但抑制凋亡细胞诱导的Rac2表达的上调。同时利用流式细胞术检测两组单核巨噬细胞胞葬能力,发现ALDH2-rs671突变的巨噬细胞,胞葬能力相比于ALDH2-WT巨噬细胞显著下降。利用ALDH2-WT病毒和ALDH2-rs671病毒,将二者分别回补到ALDH2-/-巨噬细胞中,发现回补ALDH2-WT可以挽救其受损的胞葬作用,而回补ALDH2-rs671则无法挽救其受损的胞葬作用。研究结论1.巨噬细胞中ALDH2基因缺乏/突变通过抑制胞葬作用进而促进动脉粥样硬化进展。2.巨噬细胞中ALDH2蛋白通过与Rac2蛋白直接结合,抑制Rac2蛋白泛素化,进而发挥稳定Rac2蛋白并促进胞葬的作用。3.ALDH2或Rac2有望成为动脉粥样硬化的治疗靶点。