复杂异质的木素是自然界中最抗降解的生物聚合物,它保护纤维素和半纤维素免受微生物降解,因此木素的生物降解是陆生生态系统碳循环的限速步骤。另外,木素生物降解的研究有助于木质纤维素原料生物转化技术的发展和生物修复的应用。担子菌纲的白腐真菌是木素最有效的降解者。Phanerochaete chrysosporium是木素白腐降解研究的主要白腐菌之一。已知参与其木素降解的组分包括多种木素降解酶,低分子量的糖肽,还原因子以及一些小分子物质。但其降解木素的机制尚不明确。本论文采用两条路线来研究P. chrysosporium降解杨木纤维素酶解木素(CEL)的机制,一条是利用纯化的过氧化物酶构建杨木CEL的体外降解系统,另一条是利用已经申请专利的膜连装置研究P. chrysosporium的菌丝体直接降解杨木CEL的胞外活性组分。首先,从杨木中制备了CEL,在P. chrysosporium产过氧化物酶优化的条件下纯化了木素过氧化物酶(LiP)和锰过氧化物酶(MnP)并探讨了其木素降解酶共高产的碳源。接着利用纯化的LiP、MnP和吡喃糖2-氧化酶(P20)进行了杨木CEL体外降解系统构建的实验;在P. chrysosporium产过氧化物酶的优化条件下,采用其木素降解酶共高产的最优碳源,利用膜连装置研究了P.chrysosporium降解杨木CEL的胞外活性组分。另外,针对实验中的意外发现,进行了考马斯亮蓝G-250测定碱溶木素浓度的研究。最后利用筛选到的选择性降解的白腐菌-Trametes hirsuta lg-9对玉米秸秆的全利用进行了尝试。本论文的主要研究内容和结果如下：1.杨木CEL的制备及考马斯亮蓝G-250测定碱溶木素的浓度通过木片粉碎、脱脂、球磨磨解、纤维素酶酶解、1,4-二氧六环抽提、抽提液减压浓缩、双蒸水沉淀和冻干,得到粗CEL；进一步通过90%醋酸溶解、双蒸水对溶解液的沉淀、沉淀经真空干燥、再溶解于1,2-二氯乙烷：乙醇(2：1)的混合溶剂、乙醚沉淀、石油醚清洗和真空干燥,得到精制的杨木CEL。对其进行表征的结果为4.77%残糖量、3.25%残留蛋白质、85.1%总木素含量、Mw= 15075 g/mol、 Mn=8595 g/mol。初步研究发现考马斯亮蓝G-250(CBBG)试剂与碱溶杨木CEL和碱溶碱木素混合引起了最大吸收波长630 nnm处吸光度值的增加,与碱溶木素磺酸钠混合引起了最大吸收波长640 nmn处吸光度值的增加。进一步发现混合液在最大吸收波长处的吸光度值与碱溶木素浓度呈线性正相关。等温滴定量热实验结果以及水、4%乙醇和95%乙醇分别清洗的沉淀的红外谱图(FT-IR)对比分析显示CBBG非共价结合碱溶木素。杨木硫酸盐制浆黑液中木素浓度的测定显示,与紫外光谱法相比,CBBG法的测定结果和Klason木素更接近定量制备法。这种潜在的测定碱溶木素浓度的方法BBG法-可重复且快速简单,此外它还不受碳水化合物降解产物的干扰。2. Phanerochaete chrysosporium产过氧化物酶的优化及其过氧化物酶的纯化接种量、培养温度和藜芦醇浓度对P. chrysosporium产过氧化物酶影响的研究表明：低藜芦醇浓度时,低接种量有利于LiP和MnP的产生,高藜芦醇浓度时则高接种量有利于LiP和MnP的产生；30℃时,P. chrysosporium在第六天达到LiP的产酶峰值,39℃时,P. chrysosporium在第四天达到LiP的产酶峰值,且30℃较39℃更利于MnP的高产；藜芦醇浓度对产LiP影响存在LiP产量最高的临界浓度-3 mM,对产MnP的影响则表现为30℃培养时,低的藜芦醇浓度有利于MnP的产生,39℃培养时,较高的藜芦醇浓度则更有利于MnP的产生,但太高浓度的藜芦醇不利于MnP的高产。为了分离纯化LiP和MnP,选择了短发酵周期的39℃作为发酵温度,3 mM的藜芦醇添加入培养基,A650nm=0.65/cm的孢子悬浮液作为接种物进行静置发酵。收获4天的胞外发酵液,经超滤、Sephdex G-75的分子筛层析、超滤透析、Mono Q阴离子交换柱,纯化得到H1、B2、H3、H4、H6、H7、H8、H9和H109个组分。其中H1、H2、H6、H7、H8、H9和H10组分都具有LiP活性,同时H2还具有少量的MnP活性,H3和H4组分具有MnP活性,但还有微量的LiP活性。3.过氧化物酶和吡喃糖2-氧化酶体外协同降解杨木CELH6-H9混合酶夜组成的LiP、H3和H4混合酶液组成的MnP和来自Irpex lacteusdft-1的P20协同降解杨木CEL的研究,设计了三组系统。分别是P系统、C系统和V系统。P系统为10 mL pH4.5 20 mM琥珀酸钠缓冲溶液反应体系,其中包含10 mg杨木CEL、3IU LiP、4IU MnP、0.3IU P2O、0.15 IU灭活的过氧化氢酶、4μmol藜芦醇、5 μmol Mn2+、500μmol乳酸和500 μmol葡萄糖;C系统除了灭活的过氧化氢酶由活性过氧化氢酶取代外,其它成分与P系统相同；V系统除了加入2 μmol的维生素C外,其它成分与C系统相同。三个系统分别处理3h、6h、12h和24h。上清液的酶活测定和紫外光谱分析以及残余固体杨木CEL的GPC结果显示：三个系统上清液中溶解木素含量的增加随着处理时间的延长,基本呈增加的趋势；P系统中P2O产生的过量H2O2引起了LiP的失活,C系统中过氧化氢酶的加入微弱地恢复了LiP的活性,V系统中维生素C的加入进一步恢复了其活性；过氧化物酶和P2O能够有效地降解杨木CEL,过氧化氢酶微弱的增加了杨木CEL的降解,维生素C进一步增强了杨木CEL的降解。4.碳源对Phanerochaete chrysosporium产胞外木素降解酶的影响调查了改变生长环境中的碳源对P. chrysosporium生产胞外木素降解酶的影响。葡萄糖、纤维二糖、纤维素以及其中两两的混合物分别作为碳源。监测培养过程中木素降解酶的活性发现：葡萄糖氧化酶和乙二醛氧化酶在整个培养过程中在所有碳源的培养基中均产生；高峰值的MnP活力(0.17-0.24 IU/mL)仅在包含寡糖的培养介质中出现；LiP的活性在葡萄糖的介质中具有高的水平(峰值活性为0.21 IU/mL),但在纤维素介质中仅产生了微量的LiP(峰值活性为0.01 IU/mL).;当P. chrysosporium生长在包含纤维素的介质上时,检测到高的纤维二糖：醌氧化还原酶(峰值活性为3.33-3.99 IU/mL)和纤维二糖脱氢酶(峰值活性为0.04-00.2IU/mL)活性。这项调查表明在所调查的碳源中, P. chrysosporium利用葡萄糖和纤维素的混合物作为碳源更有利于木素降解酶的共同高产。5. Phanerochaete chrysosporium降解杨木CEL胞外活性组分的研究将膜连装置用于研究P. chrysosporium降解杨木CEL, P. chrysosporium被接种在Vessel A中,杨木CEL被放置在Vessel B中,即将P. chrysosporium的菌丝体与被降解的木素大分子在空间上隔开,排除了菌丝体吸附木素的干扰,同时安装的膜并不完全阻隔P. chrysosporium及其所分泌的胞外活性组分与木素大分子之间的相互作用。分别使用了安装1 kDa、 5 kDa和10kDa膜的膜连装置,通过VesselA和Vessel B上清液中酶活和低分子量物质活性的测定发现：P. chrysosporium在Vessel A中所分泌的胞外酶中,除了LiP和MnP的活性可以透过1K、5k和l0k的膜进入Vessel B外,其它所检测到的木素降解酶和纤维素酶的活力都不能透过1k、5k和10k的膜进入Vessel B;还原Fe3+和产OH·活性源于P. chrysosporium培养过程中分泌的活性物质,且小于1k的部分已经具有还原Fe3+和产OH·的活性。VesselB中剩余的固体杨木CEL的GPC结果显示：杨木CEL的降解程度随着膜连装置中膜孔径的增加而增加。实验组、对照A和对照B的Vessel A和Vessel B的上清液LC-MS/MS的对比分析发现：在实验组的Vessel A中P. chrysosporium产生了一些化合物,它们在质谱中具有最大分子量700-1000左右的片段；这些化合物在对照A的Vessel A和实验组的Vessel B上清液中均未出现,可能是P. chrysosporium降解杨木CEL的关键组分。6.白腐菌木素降解用于玉米秸秆全利用的一种方式T. hirsuta lg-9是从9种菌株中筛选出的选择性降解玉米秸皮能力最强的菌株。该菌株被用于处理玉米秸皮(CSR),接着被精磨成纸浆。菌株的生物处理引起了纸浆所抄造的纸张强度和白度的下降,但精磨中的能耗(ECR)降低。ECR与菌株处理过程的酶活、菌株处理后玉米秸皮的得率(Y)和菌株处理后玉米秸皮红外光谱上的相对吸收强度的Pearson相关分析显示：当显著性水平α=0.1,Y生物处理后玉米秸皮红外谱图上3414 cm-1处的相对吸光度值(A3414)和1653 cm-1处的相对吸光度值(A1653)与ECR有高的线性相关,且ECR与Y和A3414呈正相关,与A1653呈负相关。进一步,ECR作为因变量,Y，A3414和A1653作为自变量的多元回归的结果表明通过测定菌株处理的CSR的参数能够预测ECR。剩下的玉米髓(CSP)被脱除木素为脱除木素的玉米髓(DCSP)。DCSP添加到杨木碱性过氧化氢机械浆(APMP)中,提高了杨木APMP的强度同时抑制了返黄。CSR的生物机械制浆具有生产低成本、绿色纸浆的潜力,同时DCSP可以作为纸浆添加剂,实现了玉米秸秆的全利用。