论文部分内容阅读
肠道病毒感染可引发手足口病(HFMD),HFMD属于急性传染病,婴幼儿为主要发病人群。临床上患者年龄越小对身体危害越为严重,常出现发病迅速、病情加重趋势明显,愈后不理想等临床症状。目前,HFMD已经对婴幼儿的身体健康甚至生命安全造成了严重威胁。肠道病毒71型(EV71)作为HFMD主要病原体之一,感染性强,可以导致HFMD较高的发病率,症状严重者则表现出神经系统症状,且已有死亡病例出现。目前,EV71常见检测方法有:细胞接种、乳鼠接种、血清中和试验以及RT-PCR方法,这些方法成本高,耗时长且RT-PCR常易出现假阳性,给早期临床诊断带来了一定的困扰。因此,建立一种又快又准且易于操作的检测方法,已经成为当前EV71诊断工作的迫切要求。本试验结合单抗和ELISA方法的优势,开展EV71 VP1单抗的制备,并以此为基础,建立了EV71双抗夹心ELISA方法。本论文以真核表达载体EV71 PcDNA3.1-VP1质粒为免疫抗原,通过细胞融合及三次亚克隆筛选,获得了EV71 VP1单抗两株,分别命名为单抗CL-I和单抗CL-II。本论文应用在线分析软件对EV71 VP1基因进行生物信息学分析,发现EV71VP1 ORF基因全长891个核苷酸,共编码297个氨基酸。蛋白为酸性。Blast分析获知EV71 VP1氨基酸序列与Nagoya(AB747373.1)同源性高达100%,说明本试验所获得的EV71 VP1基因具有典型的代表性,另外发现EV71 VP1氨基酸序列与Nagoya(AB482183.1)同源性达到99.8%,同时,B细胞抗原表位共9个,T细胞最适MHCI分子抗原表位共6个,分别为氨基酸KLTDPPAQV(176-208位)和RIYMRMKHV(243-251位)。本实验选用自主制备的EV71单抗CL-II为包被抗体,建立EV71双抗夹心ELISA方法并优化其反应条件。同时检测临床EV71血样25份和健康儿童血清样品24份,以病毒分离和RT-PCR检测方法做对比,三种方法符合率高。表明EV71双抗夹心ELISA方法稳定性好,可用于EV71的临床快速检测。本研究为获得优良的防治HFMD的临床诊断试剂奠定了理论基础,提高基层实验室对EV71的检测技术,同时有着可观的商业前景及价值。