论文部分内容阅读
乙型肝炎病毒感染导致的乙型肝炎是世界性传染病,同时也是中国最严重的传染病,在中国具有30年以上的传染史。其高发的耐药性以及诱发肝硬化/肝癌导致了严重的中国医疗问题和经济负担。HBV基因组(HBV-DNA)由不闭合的双链环形结构DNA组成,含约3200个核苷酸,主要分为P、C、X、S四个区。HBV DNA具有高度突变性,并由此形成了HBV DNA不同的基因型。耐药的产生和肝硬化/肝癌的发展与乙肝病毒基因型和基因突变直接相关。本课题观察了西北地区较大样本量的乙肝患者HBV基因突变的情况,发现了系列新的HBV遗传特性以及新的病程标志性位点,详细分析了基因型、基因突变与临床表现的相关性,为最终建立乙肝病毒感染相关性疾病的个体化诊断奠定了基础。实验一:乙型肝炎病毒基因生物信息学分析及引物设计通过使用生物信息学分析方法,针对NCBI数据库中包含A~H8个基因型的49例HBV基因组全序列进行blast分析比较,获得了HBV P(S)基因区可覆盖8个型的分型基因片段、P基因突变热点区扩增片段、BCP-PreC/C基因区突变热点扩增片段,设计了相应区域PCR扩增引物;实验验证了各目标区域PCR扩增、DNA测序的可行性,建立并优化了实验条件。实验二:HBV P基因区突变分析与核苷类药物治疗耐药相关性研究使用生物信息学分析以及Sanger测序法,针对HBV未用药者、核苷类药物治疗发生临床耐药的慢性乙肝患者血液标本以及肝硬化/肝癌患者组织样本,进行了所感染的HBV P基因区测序分析,对DNA测序结果应用自主研发软件HBV liner、HBVdrug guide和NCBI Genotyping tool软件的对比分析,证实了HBV liner软件能够有效判断基因型;HBV drug guide软件能够准确分析基因变异;数据分析结果显示,中国西北地区HBV感染者的基因型分布以C基因型为主(59.31%),B基因型其次(38.35%),D基因型较少(2.34%),未见A基因型;P区基因在核苷类药物的压力下出现rt169(43.40%)、rt180(47.17%)、rt181(1.89%)、rt202(5.67%)、rt204(32.08%)、rt236(3.77%)、rt250(1.89%)突变,其中rt169突变与恩替卡韦相关,rt180突变与拉米夫定、恩替卡韦和替比夫定相关,rt204突变与拉米夫定和替比夫定相关;发现了B基因型存在rt169和rt180的天然突变,突变比例在未用药组、耐药组和肝硬化肝癌组达到平均99%以上,rtI169同义突变与rtL180F错义突变的产生可能与长期药物压力下进化相关,该2个突变具有潜在遗传变异性,说明我国乙肝存在遗传漂变可能性。实验三:HBV BCP-PreC/C基因区突变分析与肝硬化/肝癌的临床相关性研究使用生物信息学分析以及Sanger测序法,针对HBV未用药者的外周血标本、肝硬化/肝癌患者的手术切除病理标本,进行了所感染的HBV BCP-PreC/C基因区突变与临床表现的相关性分析,对DNA测序结果进行了自主研发软件HBV drug guide的对比分析,证实了HBV drug guide软件对该区域突变分析的可行性和优势性;发现该区域基因在未用药组和肝硬化/肝癌组临床标本中具有1762/1764位置的多发突变,突变比例平均50%以上,以ALT、AST数值40U/L为界限,关联性对比其他位点分析发现1762/1764的突变与未突变样本间比较具有统计学差异,P<0.05,1762/1764突变与肝损伤呈正相关;1896/1899突变在未用药组中以HBeAg<1为界限,关联性对比1762/1764等其他位点分析发现1896/1899的突变与未突变样本间比较具有统计学差异,P<0.0001。1896/1899突变与HBeAg呈负相关;首次发现了HBV B基因型感染者存在G1799C新突变,在肝硬化/肝癌组的B基因型样本中发现G1799C突变与未突变比例具有统计学差异,P<0.0001,G1799C与肝硬化/肝癌呈正相关性,由于其与X蛋白变异相关,说明该位点可作为乙肝病毒导致肝硬化/肝癌的标志性位点。