目的：1．探讨壳聚糖-β-磷酸三钙生物材料作为可注射组织工程骨支架料的可行性、生物相容性，以及富血小板血浆(platelet-rich plasma，PRP)作为可注射组织工程材料生长因子的可行性。2．研究PRP对MSCs成骨分化的直接作用以及经PRP诱导后的MSCs其增殖活性、成骨分化特性，探讨PRP的成骨修复作用机制。3．制备适合可注射骨应用的中国青山羊胫骨洞型缺损模型。4．研究新型可注射型组织工程骨壳聚糖—β-磷酸三钙(β-TCP)／PRP／骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，MSCs)对青山羊胫骨洞型骨缺损的修复能力。方法：1．将中国青山羊MSCs体外培养并经地塞米松诱导，取第三代MSCs用于试验。将固化后的壳聚糖—β-磷酸三钙与MSCs体外复合培养，分为空白对照组和材料组，MTT法进行细胞增殖检测，倒置相差显微镜进行细胞行态学观察，评价可注射材料的细胞相容性；将液相的壳聚糖—β-磷酸三钙与MSCs混合，待固化成形后切成小块，体外培养后，扫描电镜观察细胞生长情况，评价壳聚糖—β-磷酸三钙作为可注射组织工程骨支架料的可行性。另将体外培养的第3代MSCs用于实验，将PRP与可注射材料混合，分为空白对照组、单纯材料组、材料／PRP组，MTT法进行细胞增殖检测，倒置相差显微镜进行细胞形态学观察，评价PRP作为可注射材料的生长因子的可行性。2．采用人和青山羊的MSCs，分为单纯血清培养组、DEX诱导组、PRP诱导组，通过碱性磷酸酶染色、钙沉积染色评价PRP对碱性磷酸酶、钙沉积的影响，采用人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cellsHMSCs)，通过半定量RT-PCR检测的PRP对HMSCs的碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)、骨连接蛋白(osteonectin，ON)、骨钙素(Osteocalcin，0C)、Ⅰ型胶原(Collagen typeⅠ，Coll-Ⅰ)、中心结合因子(core binding factor alpha 1，Cbfal)、TGF-β1(transforming growth factor betalTGF-β1)基因的表达影响，评价PRP对MSCs的成骨分化的诱导作用。3．将PRP诱导后的HMSCs和未诱导的tNSCs分为两组，通过MTT法进行细胞增殖检测，倒置相差显微镜进行细胞形态学观察，评价PRP诱导后的HMSCs增殖活性；以未诱导的HMSCs单纯血清培养为对照组，PRP诱导后的HMSCs单纯血清培养为PRP组，PRP诱导后的ttMSCs进行DEX诱导为DEX组，通过碱性磷酸酶染色、钙沉积染色、半定量RT-PCR检测HMSCs的ALP、OC、ON、Coll-Ⅰ、Cbfal、TGF-β1基因的表达来评价PRP诱导过的HMSCs成骨分化的能力。4．于中国青山羊双侧胫骨内侧平台下制作直径1.2cm的圆洞型骨缺损，术后4、8w，通过X片观察、硬组织切片形组织学观察，图像分析评价可注射骨用中国青山羊胫骨洞型缺损动物模型的可靠性。5．采用中国青山羊双侧胫骨平台下圆洞型骨缺损模型。30只中国青山羊随机分为5组：空白组：骨缺损部不植入任何组织工程材料；单纯材料组：单纯植入组织工程材料壳聚糖β-磷酸三钙；PRP组：植入单纯复合PRP的组织工程材料；MSCs组：植入单纯复合MSCs的组织工程材料；PRP／MSCs组：植入复合PRP、MSCs的组织工程材料。于术后第4、8w取出骨缺损区标本进行大体观察和组织学切片观察，图像分析骨缺损区域新生骨组织的生成比例，评价可注射工程骨的体内骨修复能力。结果：1．倒置相差显微镜下壳聚糖—β-TCP材料组细胞生长良好，与空白对照组无明显差异，细胞形态正常。随培养时间的延长，各组D570值逐渐增加，到第8d达最高。第2、4、6、8d的D570值对照组分别为0.120±0.027、0.404±0.041、0.902±0.097、1.197±0.074，材料组分别为0.116±0.021、0.372±0.051、0.878±0.064、1.139±0.094，材料／PRP组吸光度值(均数为0.626)与空白对照组(0.656)比较差异无显著性(F=2.02，P=0.157)，扫描电镜下见细胞与材料混合培养3d时，细胞可在材料表面生长，多为不规则类圆形，培养7d时，细胞数量明显增加，细胞连接成片，有大量基质形成。2．倒置相差显微镜观察壳聚糖—β-TCP／PRP组材料周边细胞生长较快，6d～7d时汇合成单层；材料组细胞生长与对照组相似，8d～10d细胞汇合成单层，所有组细胞形态正常。第2、4、6、8d的D570值空白对照组分别为0.124±0.019、0.424±0.029、0.922±0.044、1.233±0.084，材料组分别为0.118±0.024、0.398±0.054、0.887±0.111、1.193±0.118，PRP／材料组分别为0.130±0．023、0.491±0.062、1.087±0．081、1.384±0.092，不同组间有显著差异(F=17.227，P=0.000)，材料／PRP组吸光度值(均数为0.733)显著高于空白对照组(均数为0.676)和单纯材料组(均数为0.649)，单纯材料组和空白对照组差异无显著性。3．培养后第7d，同FCS组相比，PRP同时明显减少了tNSCs和羊MSCs ALP阳性细胞数，然而DEX明显增加了ALP阳性细胞数。培养后第19d，HMSCs和羊MSCs的FCS组有明显的矿盐沉积，但少有钙结节形成。同FCS组相比，PRP处理组明显减少矿盐沉积，然而DEX处理组形成大量的钙结节。同FCS组相比，DEX促进HMCs 0C在第7d的早期表达，在随后的观察时间里，DEX组表达量均高于FCS组；然而，在所有的观察时间内，PRP组0C基因无表达。DEX促进ALP基因的表达，相反，PRP抑制ALP基因的表达。PRP能促进HMSCsTGF-β1基因表达，然而DEX抑制了HMSCs TGF-β1基因表达。在各个观察时间点，PRP或DEX组Cbfal，ON，COL-Ⅰ基因表达同FCS组相比均无明显差别。4．第2、4、6、8d的D570值，FCS组分别为0.149±0.039、0.405±0.063、0.933±0.048、1.161±0.057，经PRP诱导后的MSCs(PRP组)分别为0.152±0.028、0.397±0.035、0.964±0.033、1.103±0.061，PRP组(均数为0.654)与对照组之间(均数为0.662)比较无显著性差异(F=0.311，P=0.580)。培养后第7d，同FCS组相比，PRP组ALP阳性细胞数无明显差别，DEX组明显增加了ALP阳性细胞数。培养后第19d，PRP同FCS组有明显的矿盐沉积，但少有钙结节形成，两组无明显差别，然而DEX处理组形成大量的钙结节。FCS、PRP、DEX组ALP基因表达量在实验第3d均较低，在随后的观察时间里，DEX组ALP表达量较FCS、PRP组均轻度增高，同FCS组相比，PRP组在各个观察时间点ALP表达量无明显变化，DEX促进了ALP基因的表达。FCS、PRP组于第3、7d 0C均无表达，在第12、16d表达量无差异，DEX组0C于第7d便有表达，在第12、16d的表达量均高于FCS、PRP组，DEX促进了0C的早期表达，且基因的表达量增高。在各个观察时间点，FCS、PRP、DEX组Coll-Ⅰ、ON、Cbfal基因均有明显表达，但三组基因表达量均无明显差别。FCS、PRP、DEX组不同时间点TGF-β1均有表达，在各个观察时间点里，PRP组TGF-β1表达量最高，DEX组最低，PRP组TGF-β1表达明显增高，然而DEX抑制了TGF-β1的表达。5．X片显示术后4w实验组动物骨缺损处均未见有明显密度增高区，术后8w骨缺损边缘有少量密度增高区，缺损中间无骨密度增高；实验组4w取材时大体标本显示骨缺损周边无明显骨组织形成，缺损部由纤维组织填充；术后8w骨缺损边缘有少量新骨形成，但无骨痂生长，骨缺损部仍为纤维组织填充。组织学检查示术后4w骨缺损边缘有些部位有少许不规则新生类骨质，与正常骨边界清晰可见，但多数周边部无新生类骨质，骨缺损中间为纤维组织，未见骨组织形成；术后8w骨缺损边缘新生类骨组织形成较4w时增多，但有较多边缘仍无新生类骨质，骨缺损中间为纤维组织，未见骨组织形成。术后4、8w各组骨缺损区域成骨面积比例分别为8.79±3.63％、15.41±4.21％。6．大体观察显示4w时各组表面有一层菲薄的纤维组织包裹，空白组骨缺损部硬度低于单纯材料组，PRP组、MSCs组硬度略高于单纯材料组，而PRP／MSCs组硬度最高，除空白组外，其余三组均可见骨缺损部未降解的材料。8w时空白组硬度增高，同其它三组硬度相比仍最低，PRP组、MSCs组硬度居中，PRP／MSCs组硬度最高，PRP组、MSCs组骨缺损区域表面出现连续性的新生骨，但缺损中央仍可见少量未降解的材料，PRP／MSCs组骨缺损区域表面新生骨连续，外观类似正常骨。组织学显示空白组到8w时骨缺损区域仍未修复，仅在骨缺损边缘部份区域有少量类骨质形成，骨缺损部多为纤维组织填充；材料组骨缺损边缘区域有少量类骨质形成，骨缺损区域多为小的点片状新生骨组织，中央区域到8w时无明显新生骨组织形成；PRP组与MSCs组相似，骨缺损边缘区域类骨质较单纯材料组增多，骨缺损多为点片状新生骨组织；PRP／MSCs组骨缺损边缘区域类骨质数量明显增多，骨缺损部多为点片状新生骨组织，其中大的片状新生骨组织明显增多。术后4w空白组、单纯材料组、PRP组、MSCs组、PRP／MSCs组的成骨面积比例分别为8.79±3.63、14.49±3.72、24.18±5.38、24.42±5.10、31.10±3.49，8w时分别为15.41±4.21、25.56±5.37、30.71±4.39、33.97±4.45、48.60±5.97。不同组间比较有显著差异(F=60.376，P=0.000)，单纯材料组(均数为19.92％)优于空白组(均数为12.10％)；PRP组(均数为27.44％)与MSCs间(均数为29.20％)无显著差异，两组均优于空白组和单纯材料组；PRP／MSCs组(均数为39.85％)效果最佳，均优于其它各组。不同观察时间之间有显著差异(F=72.537，P=0.000)，随着观察时间的延长，成骨面积比例增高。结论：1．MSCs／壳聚糖-β-TCP复合物表面细胞增殖良好，该生物材料具有良好的细胞相容性，可作为可注射型骨组织支架材料。复合材料中的PRP能促进体外培养的MSCs增殖，PRP作为可注射性材料壳聚糖-β-TCP中的生长因子是可行的。2．PRP对MSCs的直接效应是抑制成骨分化；PRP诱导后的HMSCs能恢复到正常的增殖速率，在体内应用是安全的；PRP诱导后的HMSCs具有与正常HMSCs相同的成骨分化能力，在体外仍可经DEX诱导向成骨细胞分化，PRP诱导后的HMGCs仍能维持较强的成骨分化活性；在PRP的直接作用下，HMGCs的TGF-β1基因表达增高，而且在PRP作用后的HMGCs仍能维持较高的TGF-β1分泌，这可能是PRP在体内促进骨修复的可能原因之一。3．中国青山羊胫骨洞型缺损模型满足了可注射骨在四肢骨缺损修复中的应用要求。该模型无需钢板支撑，制作简单；洞型缺损一端是闭合的，便于可注射的应用；成骨面积小，可靠性强；为负重区皮质骨缺损，成骨局部环境与力学环境适合于临床四肢骨缺损修复研究需求。4．负载PRP和MSCs的新型可注射组织工程骨修复中国青山羊胫骨直径1.2圆洞性骨缺损效果最佳，具有良好的临床应用前景。