论文部分内容阅读
第一章人膀胱移行细胞癌中HIF-1α、VEGF、MMP-2和Bcl-2的表达及其相关性的研究目的：探讨HIF-1α、VEGF、MMP-2和Bcl-2在BTCC中的表达及其意义。方法：用免疫组化的方法检测HIF-1α、VEGF、MMP-2和Bcl-2在42例BTCC和9例正常膀胱组织中的表达情况,并分析其与BTCC临床病理因素的关系。结果：BTCC组织中HIF-1α, VEGF, MMP-2和Bcl-2的阳性率分别为61.9%(26/42),69.0%(29/42),61.9%(26/42)和64.3%(27/42)高于正常膀胱组织的22.2%(2/9)(P<0.05),22.2%(2/9)(P<0.01),22.2%(2/9)(P<0.05)和11.1%(1/9)(P<0.01)。HIF-1α, VEGF, MMP-2和Bcl-2阳性率与BTCC的病理分级呈正相关。HIF-1α, VEGF和MMP-2的阳性率与临床分期呈正相关,Bcl-2阳性率与临床分期无关。HIF-1α的阳性率与VEGF (r=0.429, P<0.01)、MMP-2 (r=0.495, P<0.01)和Bcl-2(r=0.336,P<0.05)的阳性率呈明显正相关。结论：1、BTCC组织中HIF-1α,VEGF,MMP-2和Bcl-2的阳性率明显高于正常膀胱组织。2、BTCC组织中HIF-1α, VEGF, MMP-2和Bcl-2的阳性率高低与BTCC的肿瘤病理分级明显相关,病理分级越高,阳性率越高；3、BTCC组织中HIF-1α,VEGF,MMP-2的阳性率高低与BTCC的肿瘤临床分期明显相关,临床分期越高,阳性率越高；Bcl-2阳性率与临床分期无关。第二章YC-1对缺氧T24细胞中HIF-1α基因的mRNA及蛋白表达的影响目的：探讨YC-1作用于缺氧T24细胞后,对其HIF-1α基因的mRNA及蛋白表达的影响。方法：设定不同浓度的YC-1 (0μmol/L,1μmol/L,10μmol/L 50μmol/L,100μmol/L)作用于缺氧T24细胞12h、24h和48h(0μmol/L 12h组为对照组),半定量RT-PCR检测T24细胞中HIF-1αmRNA的变化,Western blot检测HIF-1α蛋白的表达。结果：半定量RT-PCR和Western blot检测,不同浓度(0μmol/L 1μmol/L,10μmol/L,50μmol/L,100μmol/L) YC-1于缺氧T24细胞不同时间(12h,24h,48h)后,均降低HIF-1αmRNA表达比值和其蛋白表达比值。不同浓度(0μmol/L,1μmol/L,10μmol/L,50μmol/L,100μmol/L)YC-1作用12h时HIF-1αmRNA表达比值(HIF-1α/GAPDH)分别为1.258±0.049,1.019±0.014,0.866±0.034,0.580±0.018,0.460±0.024；作用24h时分别为1.439±0.050,0.983+0.030,0.667±0.026,0.406±0.041,0.387±0.018；作用48h时分别为1.516±0.036,0.731±0.032,0.615±0.034,0.351±0.0240.317±0.019,各时间点不同浓度组与对照组比较均有下调,并且呈明显的时间和剂量效应关系(P<0.01)；Western blot检测,不同浓度(0μmol/L,1μmol/L,10μmol/L,50μmol/L,100μmol/L) YC-1作用12h时,HIF-1α蛋白表达比值(HIF-1α/GAPDH)分别为0.192±0.003,0.176±0.004,0.115±0.003,0.075±0.002,0.056±0.003；作用24h时,分别为0.203±0.004,0.150±0.003,0.088±0.003,0.055±0.004,0.035+0.002；作用48h时,分别为0.243±0.005,0.149±0.003,0.069±0.003,0.040±0.002,0.032±0.002,各时间点不同浓度组与对照组比较均有下调,并且呈明显的时间和剂量效应关系(P<0.01)。结论：YC-1能抑制缺氧T24细胞中HIF-1α基因mRNA及其蛋白的表达,并且呈明显的时间和剂量效应关系。第三章YC-1对缺氧T24细胞HIF-1α介导的基因及其生物学行为的影响目的：探讨YC-1作用于缺氧T24细胞后,对其HIF-1α介导的基因及其生物学行为,包括细胞存活率、凋亡率、侵袭力等的影响。方法：设定不同浓度的YC-1(0μmol/L,1μmol/L,10μmol/L, 50μmol/L,100μmol/L)作用于缺氧T24细胞48h后,Western blot检测VEGF.MMP-2.Bcl-2蛋白的表达,MTT法检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡率,Transwell侵袭小室法检测细胞侵袭能力。结果：不同浓度的YC-1(0μmol/L,1μmol/L,10μmol/L,50μmol/L,100μmol/L)作用于缺氧T24细胞48h后,VEGF蛋白表达比值(VEGF/GAPDH)分别为0.496±0.004,0.391±0.003,0.319±0.002,0.290±0.003,0.171±0.003；MMP-2蛋白表达比值(MMP-2/GAPDH)分别为0.611±0.006,0.435±0.003,0.323±0.002,0.298±0.002,0.231±0.003；Bcl-2蛋白表达比值(Bcl-2/GAPDH)分别为0.396±0.006,0.266±0.003,0.198±0.003,0.156±0.003,0.089±0.003,呈明显的剂量效应关系(P<0.01)。不同浓度的YC-1(0μmol/L,1μmol/L,10μmol/L,50μmol/L,100μmol/L)作用于缺氧T24细胞48h后,MTT法检测细胞存活率分别为100%,94.17%±1.18%,85.55%±1.20%,82.81%±1.27%,77.33%±0.99%；流式细胞术检测细胞凋亡率分别为5.55%±1.32%,6.55%±1.35%,9.05%±1.54%,11.83%±2.78%,16.05%+2.26%；Transwell侵袭小室法检测细胞侵袭能力,平均迁移细胞数分别为54.0+4.0,48.2+4.7,41.4+4.4,31.4+3.8,25.8+5.3,均呈明显的剂量效应关系(P<0.01)。结论：1、YC-1作用于人膀胱癌T24细胞后,对HIF-1α介导的基因VEGF.MMP-2.Bcl-2亦有明显的抑制作用,并且呈显著的剂量效应关系。2、YC-1作用于人膀胱癌T24细胞后,对T24细胞的增殖有明显抑制作用,并且呈显著的剂量效应关系。3、YC-1作用于人膀胱癌T24细胞后,明显诱导细胞凋亡,凋亡的诱导作用呈显著剂量效应关系。4、YC-1作用于人膀胱癌T24细胞后,对T24细胞的侵袭力有明显抑制作用,并且呈显著的剂量效应关系。第四章YC-1对T24细胞ERK/P38MAPK信号通路的调节作用目的：探讨YC-1是否通过ERK/P38MAPK信号通路机制作用于膀胱癌T24细胞,并由此抑制HIF-1α基因的表达。方法：将膀胱癌T24细胞用ERK和P38MAPK特异性抑制剂PD98059(25μmol/L)和SB203580(15μmol/L)预处理后,分别置入缺氧和常氧环境下培养,同时用YC-1 50μmol/L作用后,Western blot分别测定HIF-1α蛋白的表达。结果：常氧培养环境下,对照组、YC-1组、YC-1+PD98059、YC-1+SB203580组的HIF-1α蛋白表达比值(HIF-1α/GAPDH)分别为0.166±0.008,0.044±0.008,0.068±0.010,0.155±0.010,YC-1组和YC-1+PD98059组比较有显著性差异(P<0.01),YC-1组和YC-1+SB203580组比较亦有显著性差异(P<0.01)；缺氧培养环境下,则分别为0.346±0.009,0.128±0.009,0.201±0.008,0.221±00007,YC-1组和YC-l+PD98059组比较有显著性差异(P<0.01),YC-1组和YC-1+SB203580组比较亦有显著性差异(P<0.01)。结论：1、无论常氧还是缺氧状态下,YC-1对膀胱癌T24细胞HIF-1α表达的抑制作用,均能被ERK和P38MAPK的特异性抑制剂PD98059和SB203580所逆转。2、YC-1抑制膀胱癌T24细胞HIF-1α的表达可能与ERK/P38MAPK信号通路机制相关。