研究背景及目的:针对目前非小细胞肺癌治疗方法单一且预后差的现状,¹²⁵I放射性粒子近距离放疗和PD-1/PD-L1抑制剂抗肿瘤机理不同,目前关于二者联合应用治疗NSCLC还未见报道,是否能给肺癌患者带来临床收益还没有经验,基于以上分析提出近距离放疗联合PD-1抗体治疗非小细胞肺癌假说,通过体内及体外实验观察¹²⁵I放射性粒子联合PD-1抗体的疗效,评估二者联合用于治疗人非小细胞肺癌的可行性,期待通过该项研究来评估进而应用于非小细胞肺癌患者的可行性及可能机理。内容:本课题首先进行体外实验,证实联合应用抗PD-1抗体Nivolumab和近距离放疗后,是否能够更有效的抑制肿瘤细胞的生长和促进其凋亡,再进行体内实验,建立肺癌的小鼠模型,联合应用抗PD-1抗体Nivolumab和近距离放疗,验证是否可以增加疗效,使抑瘤率得到提高,检测小鼠体内的免疫情况。应用转录组分子实验探索¹²⁵I近距离放疗联合Nivolmab治疗NSCLC可能机制,通过比较组织中转录组差异,挖掘在联合治疗下发挥重要作用的基因和信号通路,为二者联合应用是否能带来临床获益提供理论依据。方法:1.¹²⁵I联合免疫调节人肺癌细胞生物学行为的研究首先检测三种肺癌细胞株PD-L1的蛋白水平,本实验利用三种肺癌细胞株,分别为H1299,SPC-A1和A549细胞株进行实验,Nivolumab主要针对PD-L1增高的情况有效,所以利用western-bloting筛选其PD-L1蛋白水平相对表达最高的细胞系作为实验所用肺癌细胞株。筛选出PD-L1相对高表达细胞株后继续实验,实验分为对照组、¹²⁵I组、Nivolumab组、¹²⁵I联合Nivolumab组,对选定肺癌细胞系分别给予Nivolumab（工作浓度100nM）及¹²⁵I粒子持续低剂量率照射（细胞培养平面初始剂量率为2.59cGy/h,对于指数生长期细胞予以10Gy照射）,采用MTT法比较各组间肿瘤细胞生长抑制率,随后进行细胞凋亡实验和Transwell侵袭实验等生物学行为研究。2.联合疗法在小鼠移植瘤模型中的疗效研究建立小鼠移植瘤模型,经筛选后PD-L1高表达肺癌细胞株经过荧光质粒转染后种植在小鼠前胸,观察移植瘤生长情况,荧光摄影测量移植肿瘤的大小,并且当移植肿瘤的体积在约一周后达到100mm 3或更多时,可以开始分组实验。将移植的肿瘤小鼠随机分成三组,¹²⁵I组、Nivolumab组、¹²⁵I联合Nivolumab组。开始药物处理以及植入¹²⁵I粒子。粒子的初始活性为1mCi,无菌条件下,将放射性¹²⁵I植入肿瘤中心,并将热释光剂量计置于与粒子平行位置,二者距离用游标卡尺测量固定为0.5cm,Nivolumab采用尾静脉注射给药1mg/kg。继续饲养小鼠3周,观察小鼠状态并且每周测量两次肿瘤体积变化计算抑瘤率;肿瘤组织标本取材,切片做HE染色及免疫组化等组织病理学鉴定;检测小鼠移植瘤中PD-L1蛋白以及PD-L1 mRNA表达的水平。3.通过转录组分子实验对联合治疗机制的研究取荷瘤鼠不同处理组病理标本。提取组织RNA,片段分选后上机测序,测序数据下机后质控过滤,应用RSEM软件计算各个样本中基因表达量,比较样本间表达差异。基于比对结果利用edgeR软件分析基因在各样本中的差异表达情况,对差异表达基因进行GO和KEGG通路富集分析,查找在差异实验结果之后,起重要作用的基因和信号通路。结果:1.肺癌细胞系的筛选及细胞生物学实验通过western-bloting检测三种肺癌细胞系,H1299中PD-L1蛋白表达量最高。选取H1299为实验用肺癌细胞株,对¹²⁵I组、Nivolumab组、¹²⁵I联合Nivolumab组肺癌细胞系分别予以药物及照射处理,结果显示,与其他两组相比,联合治疗组肿瘤抑制率更高。流式细胞实验显示,联合治疗组肿瘤细胞凋亡率明显高于单处理组。Transwell实验表明联合治疗能更有效抑制肿瘤细胞侵袭。2.荷瘤鼠体内实验通过对荷瘤鼠模型不同治疗方法的观察测量,绘制曲线并计算肿瘤抑制率,发现联合治疗组比较放射性粒子植入组和免疫治疗组对肿瘤生长抑制更加明显,效果显著。取移植瘤组织进行分析发现,PD-L1蛋白水平及mRNA表达量¹²⁵I组最高,Nivolumab组次之,联合治疗组最低。3.转录组分子实验通过比较不同处理条件下的细胞系转录组差异,挖掘在不同生境下发挥重要作用的基因和信号通路。结果发现651个mRNA发生明显的上调或下调。GO分析显示来自上调的mRNA参与细胞对细胞因子刺激的反应、细胞因子反应,免疫反应,细胞因子介导的信号传导,对化学物质的反应和细胞因子活性。细胞侵袭转移相关的mRNA有所下调。随后的通路分析显示,异常的上调mRNA参与IL23介导的信号转导事件,干扰素γ信号传导,NK-kapaB信号通路,趋化因子与趋化因子的受体结合,鸟苷结合蛋白偶联受体（GPCR）配体结合,与生物代谢紊乱有关氧化酶的调节等通路。通路分析中下调的mRNA具有Ca²⁺通路和NK细胞介导的细胞毒性中的ras非依赖性通路等细胞分子生物学特性。结论:1.在PD-L1高表达非小细胞肺癌细胞株中,¹²⁵I联合Nivolumab能够显著抑制肿瘤细胞生长,增加其凋亡并且抑制肿瘤侵袭等生物学行为。2.体外实验显示,¹²⁵I联合Nivolumab能够有效抑制荷瘤鼠肿瘤生长,取移植瘤组织进行分析发现,联合治疗组PD-L1蛋白水平及mRNA表达量较单因素治疗组更低。3.转录组实验表明,联合治疗可影响mRNA异常表达。GO分析显示来自上调的mRNA参与细胞对细胞因子刺激的反应、细胞因子反应,免疫反应,细胞因子介导的信号传导,对化学物质的反应和细胞因子活性。细胞侵袭转移相关的mRNA有所下调。随后的通路分析显示,异常的上调mRNA参与IL23介导的信号转导通路,干扰素γ信号传导通路,NK-kapaB信号通路,趋化因子与趋化因子的受体结合通路,鸟苷结合蛋白偶联受体（GPCR）配体结合通路,与生物代谢紊乱有关氧化酶的调节等通路。通路分析中下调的mRNA有Ca²⁺通路和NK细胞介导的细胞毒性中的ras非依赖性通路。