目的骨骼是人体重要的组成器官,创伤、肿瘤、感染及老龄化等造成骨组织缺损严重威胁人体健康,大规模骨缺损需要手术植入骨材料修复骨损伤。骨缺损愈合延迟容易给予细菌生长空间导致骨髓炎,骨髓炎则抑制骨缺损的愈合,两者相互作用形成恶性循环。因此需及时治疗修复骨缺损。目前临床有多种移植骨或骨修复材料,但都有各自的局限性。随着科学的进步和材料学与技术的迅速发展,生物材料领域出现一系列骨修复、移植的替代材料,给骨缺损治疗提供了一个新的发展方向。理想的骨移植替代物应该具备以下条件：良好的生物相容性；局部形成微酸性生物环境；利于血管和成骨细胞长入；完全生物降解周期约8周；兼具骨生成性、骨传导性和骨诱导性。临床现已有多种人工生物材料,每种材料都有自身的优缺点,复合材料可以相互融合,取长补短,同时具备多种理想骨材料的特征,使生物材料更加接近自然骨。本研究课题主要制备硅锆钙石(Ca3ZrSi209, Baghdadite)／壳聚糖水凝胶和锶/α-半水硫酸钙／壳聚糖两种新型骨替代复合材料,并对其性能和生物相容性进行验证,为以后的进入临床、广泛应用于骨修复治疗提供科学依据。方法本研究课题分为两大部分：Baghdadite-壳聚糖水凝胶复合材料和锶/a-半水硫酸钙／壳聚糖复合材料。第一章Baghdadite-壳聚糖水凝胶复合物制备和理化性质检测。本章节采用溶胶-凝胶加工工艺方案合成制备Ca3ZrSi209 (Baghdadite),溶解制备Baghdadite-壳聚糖凝胶,并进行成分研究及相应理化生性能研究。1、成分研究：采用X射线衍射分析(X-Ray Diffraction, XRD)方法对Baghdadite-壳聚糖凝胶复合物进行成分测定。傅里叶红外光谱分析(Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)分析复合物化学官能基团。2、理化性质研究：(1)PH值测定和直径测定：实验分为7组：空白对照组、单纯壳聚糖凝胶组、0.05%Baghdadite-壳聚糖凝胶组、0.25% Baghdadite-壳聚糖凝胶组、0.5% Baghdadite-壳聚糖凝胶组、1% Baghdadite-壳聚糖凝胶组、2.5% Baghdadite-壳聚糖凝胶组。各组加入等体积PBS溶液浸泡,连续7天对溶液的PH值进行测定,同时测定记录样本的直径,计算体积变化比例。(2)胶凝时间：实验根据加入或不加入交联剂京尼平分为,单纯壳聚+京尼平组、0.5% Baghdadite-壳聚糖+京尼平组、1% Baghdadite-壳聚糖+京尼平组、单纯壳聚糖组、0.5% Baghdadite-壳聚糖组、1% Baghdadite-壳聚糖组,6组。将6组未凝混合液分别加入96孔板中37℃反应,采用色度记录仪记录成胶过程中450nm、492nm及570 nm波长的光波色度以计算样本胶凝时间。(3)电子显微镜扫描(Scanning electron microscopy,SEM):将0.5%、1%的Baghdadite-壳聚糖凝胶及纯壳聚糖凝胶3组材料进行电子显微镜扫描观察材料表面结构。(4)离子释放实验：实验分为1%Baghdadite-壳聚糖凝胶+超纯水组、1%Baghdadite-壳聚糖+PBS组、Baghdadite粉剂+超纯水组、Baghdadite粉剂+PBS组4组。未成胶时Baghdadite-壳聚糖-京尼平混合液加入96孔板中放入37℃反应过夜成胶。每孔分别加入相应的超纯水和PBS溶液后,在0、1、3、7、10、13、16、19、22、25、28天取样检测Ca、Si、Zr离子,每次取样后补充相应超纯水或PBS。(5)溶胀比及蒸发率：将1%Baghdadite-壳聚糖凝胶及纯壳聚糖凝胶样本置于超纯水中,分别在1-7天各时间点测定其重量,并计算与原始重量比值,测定其溶胀比。将0.5%、1%Baghdadite-壳聚糖凝胶及纯壳聚糖凝胶三组样本暴露于37℃空气中,分别在1-7天各时间点测定其重量,计算与原始重量比值,测定其蒸发率。(6)亲水性测试：将去离子水液滴加于0.5%、1%Baghdadite-壳聚糖凝胶及纯壳聚糖凝胶三组材料表面,用相机拍照记录其接触角,测定材料的亲水性。3、力学性能研究：实验分为1%Baghdadite-壳聚糖凝胶及纯壳聚糖凝胶两组材料,每组5个,超纯水中保持湿润过夜,分别采用流体力学测定仪测定储存模量及损耗模量进行流体力学测试,及采用压力测定仪测定弹性模量及屈服强度进行压力测试。4、采用成骨细胞分化实验进行生物性能研究：将实验分成3组：Baghdadite-壳聚糖凝胶、纯壳聚糖凝胶以及无样本对照组,每组4个复孔。凝胶样本加入PBS溶液中保持湿润37℃过夜,第二日紫外线消毒备用。将60万个/ml浓度的成骨细胞植入培养,分别在第1天、第3天、第7天检测成骨细胞增殖情况。第二章锶/a-半水硫酸钙／壳聚糖复合物的制备和生物相容性评估。采用共沉淀及水热反应技术制备含锶a-半水硫酸钙,壳聚糖包裹含锶α-半水硫酸钙形成锶/a-半水硫酸钙／壳聚糖复合物。参照国家标准GB/T16886医疗器械生物学评价(第12部分)：样品制备与参照样品规制备锶/a-半水硫酸钙／壳聚糖复合物浸提液,依据国家标准GB/T16886医用生物材料(植入体)安全性评价的有关标准,对锶/a-半水硫酸钙／壳聚糖复合物进行以下生物相容性评价：(1)细胞毒性试验：采用L929系细胞株分成6组分别于培养24、48及72小时进行MTT实验：25%浸提液组、50%浸提液组、75%浸提液组、100%浸提液组、阴性对照组(100μlDMEM培养液)、阳性对照组(100μl 0.64%苯酚溶液),比较各种吸光度(A490)值,计算细胞相对增殖率,采用六级毒性分级法进行评价。(2)遗传毒性试验：将昆明小鼠分成实验组(浸提液)、阴性对照组(生理盐水)和阳性对照组(环磷酰胺)3组,每组雌、雄各5只。采用小鼠骨髓嗜多染红细胞微核方法测定,比较各组不同性别小鼠嗜多染红细胞中微核细胞率、嗜多染红细胞与正染红细胞比值的差异,以评价材料的遗传毒性。(3)全身急性毒性试验：20只昆明小鼠随机分成实验组和阴性对照组,分别以0.05 ml/g尾静脉注射浸提液和生理盐水,记录注射后4、24、48和72小时小鼠的一般状态(包括体重)、毒性表现和死亡数,评价材料毒性程度。(4)亚急性毒性试验：取20只昆明小鼠,随机分为实验组(腹腔内注射浸提液)和对照组(腹腔内注射生理盐水)。注射前、注射后第7天和第14天各组小鼠进行体重测量、血液学检查(眼眶静脉丛采血测定红细胞数、白细胞数、淋巴细胞百分比、血红蛋白浓度、中性粒细胞)、生化检查(尾静脉采血分离血清测定谷草转氨酶、谷丙转氨酶、尿素氮、肌酐、碱性磷酸酶等)。临床观察皮肤被毛、眼与黏膜的改变,以及呼吸、循环、自主和中枢神经系统、躯体运动神经活动性和行为模式等状况。(5)皮肤刺激试验：20只清洁级SD大鼠,每只大鼠背部左侧为试验组(材料浸提液),右侧为对照组(生理盐水),观察记录24、48、72h各接触部位皮肤出现红斑水肿的情况,并进行相应分级。(6)皮内致敏试验：豚鼠左边为实验组,右侧为对照组。实验组A点注弗氏完全佐剂+生理盐水(1：1),B点注射未稀释的100%浸提液,C点注射弗氏完全佐剂+浸提液(1：1)；而对照组A点注射弗氏完全佐剂+生理盐水(1：1),B点注射生理盐水,C点注射弗氏完全佐剂+生理盐水(1：1),分别在注射后的24、48、72h进行观察皮肤反应程度并记录评分。(7)皮下肌肉植入实验：将锶/α-半水硫酸钙／壳聚糖复合材料加工成直径3 mm、长度为10 mm圆柱形颗粒。取9只清洁级SD大鼠,在大鼠脊柱中线两侧约1 cm处各选1个植入点,左侧植入实验组(锶/a-半水硫酸钙／壳聚糖复合材料),右侧作为空白对照组(切开但不植入),观察动物的活动及进食情况,切口反应情况。苏木精-伊红(HE)染色光镜下观察术后1、4、12周大鼠各植入点周围炎性反应和囊腔的形成情况,并进行评分分级。结果一、Baghdadite-壳聚糖水凝胶复合物的结果：1、经过X射线衍射(X-Ray Diffraction, XRD)和傅里叶红外光谱分析(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)对Baghdadite-壳聚糖凝胶复合物进行成分分析和化学官能基团分析,确认成功得到Baghdadite-壳聚糖凝胶复合材料。2、在单纯壳聚糖凝胶组,和0.05%、0.25%、0.5%、1%、2.5%Baghdadite-壳聚糖凝胶组中,0.5%、1%Baghdadite-壳聚糖凝胶PH值比其他浓度的凝胶更接近7,具有更好的PH稳定性。而随着Baghdadite含量的增加,复合凝胶的在PBS中收缩度减小,收缩度越小,更有利于材料的稳定。综合以上结果,我们选定1%为进行下一步实验的凝胶浓度。3、色度仪检测确定0.5%Baghdadite-壳聚糖凝胶胶凝时间为240～260分钟,1%Baghdadite-壳聚糖凝胶胶凝时间为245-260分钟。4、电子显微镜扫描检查(SEM)发现随着Baghdadite含量的增加,材料表面变得不光滑。1% Baghdadite-壳聚糖凝胶中见Baghdadite颗粒均匀散布在壳聚糖凝胶里面。5、离子释放实验发现在超纯水中和PBS中Baghdadite-壳聚糖凝胶的Ca2+释放速率比Baghdadite粉末更快；而Si离子的释放在超纯水和PBS溶液中的结果相反,但PBS溶液中Baghdadite-壳聚糖凝胶的Si离子释放速率仍然比Baghdadite粉末更快。而Zr离子释放浓度低未能达到检测浓度。6、1% Baghdadite-壳聚糖凝胶在去离子水中2小时内无明显吸水膨胀,反而因PH值的原因缓慢脱水。15小时内各材料的蒸发速率从大到小顺序依次为,壳聚糖凝胶、0.5% Baghdadite-壳聚糖凝胶、1%Baghdadite-壳聚糖凝胶。说明1% Baghdadite-壳聚糖凝胶具有稳定的溶胀比蒸发率。7、亲水性测试也说明1% Baghdadite-壳聚糖凝胶具有和壳聚糖凝胶相近的良好亲水性,Baghdadite含量的改变没有改变复合材料的亲水性。8、流体力学测试和压力测试显示,1% Baghdadite-壳聚糖凝胶比单纯壳聚糖凝胶具有较低储存模量及损耗模量,及较低的弹性模量及屈服强度。9、采用成骨细胞增殖实验评价材料的生物学性能,第7天Baghdadite-壳聚糖凝胶组成骨细胞增殖比壳聚糖凝胶组显著增加。二、XRD及FTIR结果确认得到目标材料。生物相容性结果：(1)毒性反应实验：无细胞毒性：(2)浸提液未使小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率发生显著改变；(3)体内植入结果表明材料及机体达到稳定状态。(4)皮内致敏实验中,符合皮内致敏试验国家标准。(5)皮肤刺激试验未见皮肤水肿等。(6)急性毒性试验未出现不良反应。(7)亚急性毒性试验中各组小鼠一般情况较好。根据毒性评定标准证明复合材料无毒性。结论(1)本研究成功合成硅锆钙石／壳聚糖水凝胶,其理化性能良好,生物相容性有待进一步验证。(2)成功制备含锶硫酸钙／壳聚糖复合材料,其具有良好的生物相容性,符合国家标准,可进一步在动物模型中验证治疗骨缺损。