多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)在茶黄素等的合成和工业有机废物的降解等方面有重要的应用价值,但酶源短缺限制了其应用。本实验室从茶树中克隆出茶多酚氧化酶基因,研究其在原核以及真核生物中融合表达;同时从天然生物材料中筛选PPO酶源,发现甘薯中含有高活性的PPO。茶树PPO可在原核表达系统中高效表达,但表达的蛋白质均为无酶活的包涵体蛋白。本论文主要研究原核表达的茶树PPO的复性和从甘薯中提取分离PPO。主要研究结果如下:　　 1.PPO包涵体蛋白的复性。实验对PPO包涵体蛋白的提取、洗涤与复性进行研究。对菌体进行细胞破碎时,使用化学裂解与超声破碎结合方法的破碎效果显著好于单独使用化学裂解或超声破碎。包涵体蛋白洗涤过程中加入0.5％Triton X-100洗涤效果较好,能有效除去杂蛋白。包涵体洗涤后用pH11.5的水溶解包涵体蛋白,通过降低pH和添加化学与生物的复性因子对包涵体进行复性,同时使用三种方法检测复性效果,分光光度计法检测复性后PPO酶活达到200U/mg,而使用HPLC法测定复性后PPO的底物降解率仅为4.5％,活性胶染色实验显示复性后PPO无显著的活性条带产生。三种方法所得结果差异较大,但综合HPLC法与活性胶染色法所得结果,证明通过降低pH和添加复性因子对包涵体进行复性的方法复性效率较低,没有达到显著的复性效果。　　 2.HPLC测定PPO酶活方法的建立。本实验建立了多酚氧化酶的HPLC检测法,确定了酶促反应的底物浓度为1.5 mmol/L,酶促反应时间为5 min,检测波长为277 nm,并在此实验条件下对PPO酶活进行重新定义:每分钟转化100 ng邻苯二酚作为一个酶活单位U。通过与分光光度计法进行比较,此方法下测得的PPO酶活与传统定义的酶活基本一致,且具有更好的稳定性和更小的误差。　　 3.甘薯PPO的提取分离。研究了不同提取和分离方法对甘薯多酚氧化酶提取和分离效率的影响。使用新鲜甘薯材料,重复提取两次后PPO的提取效率为79.92％。在pH3.5条件下进行等电点沉淀,除去了一部分上清中的杂蛋白,随后使用50％丙酮溶液除去大量甘薯储藏蛋白,最终PPO酶活回收率为52.17±1.55％,比活力为84±2 U/mg,分离得到一条分子量为40kD左右的PPO同工酶条带。　　 4.甘薯其他蛋白的提取分离。本实验在提取甘薯PPO的同时,对甘薯β-淀粉酶与储藏蛋白进行提取分离,真空冷冻干燥后得到β-淀粉酶粗的酶制剂最终酶活回收率达到128％,比活力达到3519 U/mg,纯化倍数为9.4倍,而且得到了较纯的甘薯储藏蛋白。　　 本实验针对PPO酶源短缺问题,一方面通过调节pH与添加复性因子两种新型方法对PPO的包涵体进行复性摸索,但没有起到显著的复性效果;而另一方面通过提取分离途径获取了较纯的甘薯PPO蛋白。