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再生障碍性贫血(aplastic anemia,AA)是由多种病因、多种发病机制引起的骨髓造血功能衰竭、造血细胞数量减少所引发的,以贫血、出血和感染为主要症状的一组异质性疾病。目前认为其发病主要与造血干细胞内在增殖缺陷、造血微环境功能缺陷及机体免疫功能紊乱有关。造血微环境主要由骨髓基质细胞构成,以往对造血微环境的研究多停留在基质成分的基础上。随着实验技术的不断提高,人们已经能够从骨髓中分离得到间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSC)。BMSC是中胚层起源的原始细胞,是骨髓基质细胞系的干祖细胞,是骨髓微环境的重要组成部分,本研究主要是研究AA患者的BMSC与正常BMSC的细胞形态,细胞周期,生长曲线,免疫表型,分化潜力以及分泌干细胞因子(SCF)水平等方面的生物学特性差异,从而进一步研究GATA-1, GATA-2, PPARγ和SCF基因在AA患者及正常BMSC中表达的差异,以及根据实验结果提出治疗AA的新方法,为临床应用BMSC治疗再生障碍性贫血提供实验依据。第一部分目的：研究AA患者BMSC生物学特性的改变。方法：与正常人骨髓的BMSC为对照,观察其细胞形态,生长曲线、流式细胞仪检测细胞周期、免疫表型,ELISA检测AA患者BMSC与正常BMSC分泌的SCF区别,取上述所得的单克隆来源的扩增细胞分别向脂肪细胞及成骨细胞定向诱导。结果：提示AA患者BMSC为贴壁成纤维细胞样,原代细胞形态不均一,第三代细胞铺满瓶底后呈长梭形、漩涡状分布,形态均一,AA组生长时间长于对照组。比较AA患者BMSC与正常BMSC的表面标志,结果显示两者无明显差异,均不表达CD34、CD106,表达CD29、CD44。ELISA检测示AA患者BMSC分泌SCF水平,AA组为(95.6±1.45) pg/ml,对照组为(125.28±18.12) pg/ml, (P=0.002, P<0.01),具有显著统计学差异。结论：通过我们对AA患者BMSC的生物学特性的初步研究,AA的BMSC的表型与已知正常BMSC一致,并保持多向分化潜能,但其生长明显缓慢,存在生长数量缺陷和质量缺陷,可能是导致AA的骨髓微环境的缺陷的原因之一。第二部分目的：检测(?)GATA-1, GATA-2, PPARγ,和SCF基因在AA患者及正常BMSC中的表达。方法：采用荧光定量PCR方法检钡(?)GATA-1, GATA-2, PPARγ,和SCF基因在AA患者及正常BMSC中的表达。结果：与正常BMSC相比,AA患者的BMSC的GATA-2和SCF基因表达量降低(相对表达量分别为0.36±0.08,0.42±0.21；而PPARγ基因表达量升高(相对表达量为1.51±0.195); GATA-1与对照组相比,无显著差异(相对表达量为0.91±0.06)。结论：GATA-2, SCF基因的异常表达可能影响AA患者骨髓微环境的造血调控作用；PPARγ在AA患者BMSC中的表达显著增高,PPARγ基因的异常表达可能解释AA患者骨髓易成脂的原因,这些基因的研究是否对AA发病机制及治疗提供新的思路,值得进一步探讨。第三部分目的：测定脂肪细胞诱导组和中药祛脂素组两组BMSC内PPARγmRNA和蛋白水平的表达方法：采用PT-PCR及Western blotting法测定脂肪细胞诱导组和中药祛脂素组两组BMSC内PPARγmRNA和蛋白水平的表达结果：与脂肪细胞诱导组比较,中药祛脂素组脂肪细胞阳性率减低,具有显著统计学意义(P=0.047,P<0.01),中药祛脂素组PPARγmRNA水平和PPARγ蛋白水平明显下降。结论：中药祛脂素对AA的BMSC脂肪分化具有抑制作用,通过减少脂肪细胞形成、降低脂肪细胞特异性标志PPARγ的转录及蛋白表达。本研究较系统地探讨了AA患者BMSC生物学特性的改变,采用实时荧光定量PCR在基因水平研究AA患者BMSC与正常BMSC两者在造血及成脂方面的差异,同时运用RT-PCR及Western blotting法测定脂肪细胞诱导组和中药祛脂素组两组细胞内PPARγmRNA和蛋白水平的表达,通过减少脂肪细胞形成、降低脂肪细胞特异性标志PPARγ的转录及蛋白表达,帮助恢复骨髓造血功能,为临床应用BMSC治疗AA提供实验依据。