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阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)又称老年痴呆症,是老年人由于脑功能障碍而产生的获得性智能障碍综合症。目前临床用药主要为乙酰胆碱酯酶抑制剂等暂时改善认知症状的药物,不能从根本上治愈AD。 由于AD的致病机制复杂,对其尚无全面彻底的认识,出现了多种假说解释其病因。其中,淀粉样蛋白学说越来越受到普遍接受。该学说认为,β-淀粉样蛋白(β-amyloid peptides, Aβ)聚集形成老年斑,在AD的病理发生和发展中起重要作用。Aβ是β-淀粉样前体蛋白(β-amyloid precursor protein,APP)先后经β、γ-分泌酶水解的产物。处于上游的β-分泌酶是治疗AD的关键靶点。β-分泌酶包括BACE1(βamyloid cleaving enzyme1, Asp2, memapsin2)和BACE2(βamyloid cleaving enzyme2, Asp1, memapsin1)。抑制BACE1是防治AD的重要途径。 目前,越来越多的BACE1抑制剂表现出良好的生物活性和应用前景,但受多种因素影响,仅有一个BACE1抑制剂(CTS-21166)成功完成了Ⅱ期临床研究。已经报道的BACE1抑制剂主要包括肽(或拟肽)类、非肽类两大类。从天然产物及BACE1的代谢途径寻找BACE1抑制剂也倍受关注。 本研究分别从BACE1的作用机制、代谢途径及天然产物出发,合成了三个先导化合物,并设计合成了三类、共计56个目标化合物。以EGCG为阳性对照,应用时间分辨荧光法测定目标化合物体外对BACE1的抑制作用,并对其构效关系分别进行了讨论。 BACE1属于天冬氨酰蛋白酶家族,该家族酶的作用机制是其催化中心两个Asp的β羧基侧链与底物相互作用,经过四面体过渡中间态,使底物酶切位点的肽键水解断裂。基于该机制,在底物被酶切位点引入过渡中间态的模拟物以构建化合物,是设计BACE1抑制剂的一个重要方式。里程碑式的肽类BACE1抑制剂K MI-008也是基于这一方式得到。其在底物的酶切位点(P1位)引入的四面体中间态模拟结构单元为Pns[Phenylnorstatine,(2R,3S)-3-amino-2-hydroxy-4-phenylbuty-ric acid]。Pns的2位羟基、羧基形成的酰胺基与酶催化中心的Asp32、Asp228相互作用,构成了多个环状结构;Pns的苯环与酶S1口袋存在疏水作用,除Pns以外的其它部分与酶的各口袋也都有较好结合。提示羟基等富电子功能基,芳香环及环状结构在功能区的核心结构中起重要作用。本课题合成了KMI-008,并以其为先导化合物,基于天冬氨酰蛋白酶家族催化裂解机制,分别或同时引入羟基等富电子功能基团、芳香基及吡咯环等基团代替先导化合物的核心结构 Pns,设计合成了K系列共38个肽序列。通过对其进行体外活性评价,有10个目标化合物对B ACE1的抑制作用较强;其中,LK-MX-K1059、LK-MX-K1091及LK-MX-K1093的抑制作用与先导化合物KMI-008相当。对于K系列化合物,单独引入羟基等富电子功能基、吡咯环或D-芳香基,都不能得到活性较好的目标肽;但单独引入取代的L-芳香基,更换芳香环上的取代基(尤其是引入4-Cl-Phe的目标肽LK-MX-K1093),抑制作用提高;同时引入L-Phe和D-Pro(LK-MX-K1059),抑制作用与先导化合物KMI-008相当;在吡咯环的4位引入羟基、氨基等富电子功能基,不能进一步提高目标肽的抑制作用;含有L-Phe-D-Pro结构的肽序列,可能成为新型肽类BACE1抑制剂的先导化合物。去除其C端的三个氨基酸,得到的五肽仍能保持其大部分抑制作用。 应用Autodock4对所合成的K系列目标化合物与BACE1进行了分子对接,同先导化合物KMI-008进行比对,进一步分析其构效关系。对BACE1有一定抑制作用的目标化合物与先导化合物KMI-008均有一定的相似度,并具有较低的结合能。引入L-Phe-D-Pro的LK-MX-K1059与引入L-Phe-(cis,D)-Hyp的LK-MX-K1091中,D-Pro使肽主链发生了部分扭转;Pns的羟基处于吡咯环氨基形成的酰胺基与5位CH2共同构成的空间中;苯丙氨酸的苯环与Pns中的苯环位置相近,位于相同的口袋。L-Phe-D-Pro共同模拟了Pns的作用,即模拟了BACE1与底物相互作用的四面体过渡态;含有该结构的肽序列有可能成为研究新型肽类BACE1抑制剂的另一途径。Hyp的4位羟基处于酶相对松散的空间中,使两目标化合物的抑制作用没有差别。只引入L-型取代芳香丙氨酸或L(D)-4-取代的Pro,其环状结构与Pns中的苯环位置接近。在Phe的苯环上引入不同的取代基,其与酶的相互作用关系在对接结果中没有显著差别,还需另行研究。引入D型芳香丙氨酸后,整个肽链发生扭转,酶中的多个空穴都未得到适当填充。配体C端基本位于BACE1结合口袋外部,与BACE1各活性位点距离较远,相互作用较小。说明该类化合物的C末端对其活性影响作用较小。 膜蛋白RTN3(Reticulons3)是BACE1的辅助因子(Binding partner),通过阻断BACE1与底物的结合,可剂量依赖地降低BACE1活性并显著减少Aβ,同时并不影响BACE2及γ分泌酶的作用。有研究显示,RTN3的C端第31至36个氨基酸所组成的肽段(Tyr-Lys-Thr-Gln-Ile-Asp)是与BACE1结合的关键区域(Binding Domain,BD)。RTN3的部分肽片段很有可能成为无毒、高特异性的新型BACE1抑制剂的先导物。本课题截取RTN3中含有或不含BD的肽段,设计合成了10条肽序列。通过活性评价,含有与不含BD的目标肽,对BACE1都有一定的抑制作用,说明对BACE1的抑制作用很可能取决于与BD相邻的肽段,其作用机制还有待进一步研究。该类目标化合物对BACE1的抑制作用远低于已经报道的肽类BACE1抑制剂,不宜做为BACE1抑制剂的先导化合物。 有报道称,啤酒酵母Saccharomyces cerevisiae提取物S.cerevisiae K-7、植物插田泡(Rubus coreanus)中提取物Rc分别为8肽(Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-Ile-Gly-Se r)、4肽(Gly-Trp-Trp-Glu),它们对BACE1具有抑制作用。本课题合成了S.cerev-isiae K-7及Rc,并以S.cerevisiae K-7为先导化合物,对其进行了丙氨酸替换及C末端氨基酸剪切,合成了8条肽序列。通过体外活性评价,该系列目标化合物对BACE1几乎都没有抑制作用,与文献报道不同。 所有目标肽均经固相法、采用Boc/Bzl或Fmoc/tBu策略合成,Flash中压色谱纯化、RP-HPLC测定其纯度、ESI-MS或MALDI-TOF MS确定分子量、S.cerevisiae K-7的结构还经过N端氨基酸测序及氨基酸组成分析确定。为便于肽合成,共合成了4类12个氨基酸衍生物,经1H-NMR、ESI-MS、熔点及旋光度确定其结构。