目的:E2F转录因子是细胞周期中G1期进入S期的重要调控因子。同时,E2F因子与肿瘤的发生和细胞凋亡有着紧密的关系。为了研究人E2F3(E2F家族成员)转录因子的结构和功能,了解其与肿瘤发生的联系,从人组织中克隆E2F3基因,构建其原核表达载体和真核表达载体,实现其原核表达和真核表达,从而为进一步的研究奠定基础。 方法:通过Trizol法抽提人肝癌细胞的总RNA,然后逆转录制备cDNA。以cDNA为模板通过巢式PCR和桥联PCR的方法克隆E2F3基因,构建了四种E2F3基因的原核表达载体pET28a-E2F3、pET32a-E2F3、pQE30-E2F3和pGEX-4T-E2F3和一种真核表达载体pEGFP-N1-E2F3。原核表达载体转化BL21工程菌进行诱导,用Western blot检测重组蛋白。真核表达载体转染T24细胞观察克隆的E2F3基因在真核细胞中有无表达活性。 结果:成功克隆出E2F3全长基因,通过更换不同的表达载体实现了对E2F3基因的原核表达并且对表达的重组蛋白用Western方法进行了检测。另外还构建了E2F3基因的真核表达载体,通过转染T24细胞表明构建的E2F3真核表达载体具有表达活性,这为以后的细胞学实验做好了前期的准备。 结论:E2F3基因近5’端一段富含GC的序列会严重影响E2F3基因的PCR扩增,我们推测这段序列可能是E2F3基因的一个内部调控区,它可能会通过形成二级发夹结构来调控E2F3基因的表达。另外发现E2F3基因在不同的原核表达载体中存在表达差异,融合有GST的E2F3基因较易实现原核表达,这可能是因为表达载体功能元件的差异和E2F3基因本身的一些特点所致。