沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis，Ct)泌尿生殖道感染是当今世界上最常见的性传播疾病(STD)。据WHO统计，全球每年新感染约1千万例，每年耗资约40亿～50亿美元，仅次于HIV感染。衣原体持续性感染可导致女性慢性盆腔炎、不孕和异位妊娠等严重并发症。Ct生殖道感染还能提高HIV和高危型HPV传播的机率。虽然抗生素可用于治疗衣原体生殖道感染，但由于无症状性衣原体感染普遍存在，给预防Ct的感染和并发症带来很大困难。因此研制安全有效的疫苗是控制泌尿生殖道Ct感染的最好方法。人们最早试验用紫外线或热处理灭活的完整Ct原体做疫苗，在人体试验中仅取得局部、短时的保护效应，而且在部分个体可能导致机体对某种Ct抗原发生病理反应。因此目前的衣原体疫苗研究主要以Ct蛋白抗原为基础。衣原体主要外膜蛋白(Major outer membrane protein，MOMP)是引起宿主免疫反应的主要靶抗原，目前多数疫苗的研究均以鼠型沙眼衣原体(C．muridarum，以往称为MoPn)的MOMP为研究对象，包括亚单位疫苗、重组疫苗、DNA疫苗、树突状细胞疫苗等，均处在动物实验阶段，且免疫保护效果差异较大。鼠型沙眼衣原体并非人的天然病原体，人型沙眼衣原体D～K血清型是引起人类泌尿生殖道感染的主要病原体。人型沙眼衣原体与鼠型沙眼衣原体在生物学特性及致病特征上均存在一定差异。在人Ct的19个血清型中，E型为国内外最流行的血清型，占全部衣原体感染的40％以上。E型Ct流行较广的原因可能是E型具有某些生物学优势，从而增强了它们感染、传播和潜伏在宿主中的能力。与鼠型沙眼衣原体相比，感染人的Ct尤其是E型Ct对小鼠的毒力较弱，因此目前有关人Ct的疫苗研究较少。Darville等(1997)建立了E型Ct生殖道感染C57BL／6和C3H／HeN小鼠的模型；最近国内王红枫等(2006)成功建立了E型Ct的BALB／c小鼠生殖道感染模型，为我们选择E型Ct作为研究对象提供了可行性。为探索新型的沙眼衣原体疫苗，我们以E型Ct MOMP为研究对象，进行了以下研究：一．含E型Ct MOMP基因的重组腺病毒和DNA疫苗的构建寻找有效的辅佐运载系统是衣原体疫苗研制的重要目标。由于E型Ct自生殖道粘膜入侵感染，研制能有效激发局部粘膜免疫反应的疫苗显得尤为重要。复制缺陷型重组腺病毒嗜性广泛，能感染包括粘膜上皮细胞在内的多种细胞，介导外源基因在细胞内的稳定表达，并可通过类似天然感染的鼻腔接种途径在局部粘膜以及远端生殖道粘膜表面诱发特异性免疫反应；且病毒基因不与受体细胞基因组发生整合，具有良好的生物安全性，是较理想的Ct候选疫苗。DNA疫苗刺激机体免疫系统的方式与自然感染病原体的方式非常接近，具有其他疫苗不可比拟的优势而受到普遍重视。为此我们与加拿大曼尼托巴大学医学微生物系合作，从E型Ct基因组中扩增出MOMP基因，在国内外首次构建了含E型Ct MOMP基因的重组腺病毒Ad-MOMP及重组真核表达质粒pVAX1-MOMP，为进一步动物免疫及有关蛋白生物学功能的实验奠定了基础。首先，根据Genebank中E型Ct MOMP基因序列设计引物，用高保真PCR方法从E型Ct基因组DNA中扩增得到MOMP基因片段，克隆至pcDNAⅡ载体，测序后连接入腺病毒穿梭载体pDC316，经酶切鉴定及PCR测定证实pDC316-MOMP重组质粒构建正确。穿梭载体pDC316-MOMP与含腺病毒Ad5大部分基因组的辅助质粒PBHGlox△E1，3Cre共转染至HEK293细胞，在Cre-loxP重组酶作用下进行重组，包装成重组腺病毒颗粒。用PCR技术证实重组腺病毒含有E型Ct MOMP基因，RT-PCR证实重组腺病毒在感染的293细胞能有效转录MOMP基因，Western blotting检测到MOMP基因在293细胞内的表达，表明重组腺病毒Ad-MOMP构建成功。自重组质粒pcDNAⅡ-MOMP中酶切释放MOMP基因片断，克隆至真核表达载体pVAX1，构建卡那霉素抗性重组质粒pVAX1-MOMP，经酶切鉴定及PCR证实pVAX1-MOMP重组质粒构建成功。以重组质粒pVAX1-MOMP转染COS-1细胞，Western blotting方法检测MOMP能在COS-1细胞中表达，表达产物能与抗MOMP单克隆抗体特异性结合，具有良好抗原性。二．含MOMP基因的重组腺病毒与DNA疫苗联合免疫效果的研究近年来，联合免疫的研究受到学者们越来越多的关注。大量研究表明，同一种免疫原的两种不同的疫苗采用初免-加强(prime-boost)的免疫方案来接种，其免疫效果优于其中任何一种单独使用的效果。Zhang等(2000)报道用MoPn的MOMP DNA疫苗初次免疫继以MOMP ISCOM蛋白复合体加强免疫能显著增强细胞免疫及肺部SIgA产生。本研究设计了四种免疫方案，比较了DNA疫苗单独免疫、重组腺病毒Ad-MOMP单独免疫、DNA疫苗初次免疫—重组腺病毒加强免疫、重组腺病毒初次免疫—DNA疫苗加强免疫等4种免疫模式的免疫效果。相关研究国内外尚未见报道。1．重组真核表达质粒pVAX1-MOMP经肌肉注射3次免疫小鼠(间隔两周免疫一次，每次100μg)，可诱导较弱的脾细胞IFN-γ产生及血清特异性IgG、IgA反应，并且未检测到粘膜SIgA抗体，没有发生明显Th1类反应偏倚。提示重组质粒pVAX1-MOMP免疫小鼠的结果并不理想。2．重组腺病毒Ad-MOMP经鼻免疫小鼠(1×10~8Pfu／只，间隔两周免疫1次，共免疫2次)，可诱导生殖道局部粘膜SIgA抗体产生，血清IgG、IgA抗体及脾细胞IFN-γ水平均显著高于DNA疫苗，血清IgG1、IgG2a均增高，并以IgG2a为主，表明Th1类反应占优势。3．DNA疫苗初次免疫—重组腺病毒加强免疫(DNA／Ad)、重组腺病毒初次免疫—DNA疫苗加强免疫(Ad／DNA)的联合免疫策略，均能有效诱导明显强于单独免疫的生殖道局部粘膜SIgA反应、血清抗体反应以及Th1占优势的细胞免疫应答。与DNA／Ad联合免疫方案相比，Ad／DNA联合免疫方案能显著增强小鼠的Th1细胞免疫应答，表现为Ad／DNA免疫诱导的脾细胞IFN-γ水平显著高于DNA／Ad免疫，血清抗体以IgG2a增高为主。而DNA／Ad免疫产生的血清抗体和粘膜抗体水平强于Ad／DNA免疫。理想的Ct疫苗应诱导强的Th1细胞免疫反应及粘膜IgA抗体反应。本研究首次报道Ct MOMP重组腺病毒疫苗鼻腔免疫能诱导Th1反应及粘膜抗体反应；首次证实重组腺病毒初免—DNA疫苗加强的联合免疫策略能明显增强抗衣原体的Th1保护性免疫应答，并发现不同的联合免疫次序各有其不同的加强效应。大量文献已报道DNA疫苗初免、重组病毒加强可获得较好的免疫效果。最近Khanam等(2006，2007)在登革热病毒疫苗的研究中发现，腺病毒初免、DNA加强的免疫效果甚至强于DNA初免、腺病毒加强免疫。但也有文献报道，用重组病毒初免、DNA疫苗加强免疫所诱发的免疫应答并不理想。我们研究结果证实DNA／Ad和Ad／DNA联合免疫均能诱导明显强于单独免疫的免疫效应。但更重要的是，我们同时发现Ad／DNA联合免疫能显著增强小鼠的Th1细胞免疫应答，免疫效果明显强于DNA／Ad联合免疫。由于以Th1为主的细胞免疫应答在清除衣原体感染中起关键作用，因此Ad／DNA联合免疫对于衣原体免疫治疗新方案的设计有重要意义。Ad／DNA免疫增强Th1应答的机制我们推测可能与以下因素有关：1)腺病毒主要作用于树突状细胞，腺病毒初免比DNA初免能更有效的递呈MOMP抗原；2) DNA肌肉注射偏向诱导细胞免疫应答，DNA再次免疫时可能相应的细胞免疫得到更有效的加强。以上研究提示联合免疫应用较为复杂，接种顺序会影响免疫应答的强弱及类型，负载的目的抗原不同可能也会导致差异，因此针对特定抗原应对其联合免疫顺序、途径等进行具体的研究。本研究为人Ct疫苗免疫方案、免疫途径的确立及免疫保护作用等的进一步研究奠定了实验基础。联合免疫作用的机制尚需进一步研究。三．重组腺病毒转染的树突状细胞体内外免疫功能研究树突状细胞(Dendritic cell，DC)是机体内最强大的抗原递呈细胞，可诱导Th1型免疫应答，因此负载Ct抗原的DC疫苗是一个重要的研究方向。Su等(1998)研究显示，死衣原体(EB)冲击的DC能在动物体内诱导Th1保护性免疫，能抵抗衣原体的生殖道感染，并与自然感染产生的保护性相当。但完整Ct表面存在的病理性抗原可以导致机体严重的病理反应，完整衣原体冲击DC不适合应用于人体。Shaw等(2002)证实鼠肺炎沙眼衣原体(MoPn)重组MOMP蛋白冲击的DC在体外能有效激活CD4~+T细胞，分泌IL-12和IFN-γ；但重组MOMP蛋白冲击的DC回输动物后，产生了以Th2为主的抗-MOMP免疫反应，不能保护小鼠免受感染。MOMP-DC疫苗产生Th2免疫反应的机制还不是很清楚。诸多实验已证明基因修饰DC比相应抗原冲击DC能更有效的激发体内免疫效应。但至今为止，尚未见到基因修饰DC诱导抗衣原体免疫的研究报道。腺病毒由于转染效率高，可转染非增殖细胞及不整合宿主染色体DNA等优点，成为转染DC的首选病毒载体。本研究通过腺病毒介导MOMP基因转染DC，自体内、外实验分别探讨了转染DC的生物学特征以及转染DC回输后诱导的特异性免疫效应。1．用20ng／ml重组小鼠粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)及20ng／ml白细胞介素4(IL-4)从小鼠骨髓干细胞中诱导培养DC，镜下观察诱导的DC形态典型，流式检测其表面高表达CD11c、MHCⅡ类分子，中度表达CD80分子，提示诱导的DC趋于成熟。2．以不同滴度的腺病毒Ad-EGFP转染DC，48h后荧光显微镜下观察表达绿色荧光蛋白的阳性细胞数。当MOI为1000时，90％以上的DC表达绿色荧光蛋白，并且DC细胞的形态无明显变化。因此重组腺病毒Ad-MOMP按MOI为1000转染DC，48h后经流式细胞仪检测，DC表面特异性标记CD11c无明显变化，表面分子MHCⅡ和CD80均较转染前升高，其中CD80水平变化较大，明显高于未转染组和对照空病毒Ad转染组。对照空病毒Ad转染也可致MHCⅡ轻微上调，但CD80略微下调。表明Ad-MOMP转染对DC的成熟有明显促进作用，而对照空病毒Ad的促DC成熟功能不明显。3．Ad-MOMP转染DC后，用Western blotting检测到MOMP蛋白的表达，转染后DC功能显著增强，分泌大量IL-12，具有较强的刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力，并刺激T细胞分泌大量IFN-γ(2802pg／ml)。提示Ad-MOMP转染后DC可能诱导CD4~+ T细胞向Th1细胞的极化。同时空腺病毒Ad转染DC组IFN-γ含量(1010pg／ml)也显著高于未转染组(306.8pg／ml)，提示空腺病毒Ad转染DC可能有一定的促Th1极化功能。4．Ad-MOMP转染DC经尾静脉回输小鼠后，诱导高强度的Th1免疫反应，并且明显强于DNA／Ad、Ad／DNA联合免疫组，其诱导IFN-γ水平(4002.8pg／ml)分别为后两者的2.2、1.6倍；但Ad-MOMP转染DC免疫小鼠诱导的血清特异性IgG、IgA抗体及阴道分泌物中SIgA抗体基本上接近Ad／DNA组，弱于DNA／Ad组。尽管Ad-DC诱导小鼠IFN-γ含量显著低于Ad-MOMP-DC组，但也高于未转染DC组，与以上空腺病毒Ad增强DC的体外功能相一致。本研究首次应用MOMP基因转染的方式修饰DC，证实腺病毒是介导E型Ct MOMP基因修饰DC较理想的载体，腺病毒具有高的转染DC效率，能介导MOMP在DC内表达；重组腺病毒Ad-MOMP体外转染对DC形态影响不大，能促进DC的成熟，增强DC的生物学功能。而且腺病毒载体本身可能对DC生物学功能有一定影响。Ad-MOMP转染DC在体外能诱导CD4~+ T细胞向Th1细胞的极化，经尾静脉注射小鼠后可诱导高强度Th1细胞免疫为主的免疫反应，体液免疫和局部粘膜免疫也有所加强，这对于抵抗衣原体的感染具有重要意义。此结果与上述Shaw等MoPn MOMP蛋白冲击DC诱导小鼠Th2反应的研究不一致。其原因可能是单纯的MOMP蛋白质抗原冲击不能完全激活DC。而由腺病毒介导MOMP基因修饰DC一方面有利于MOMP基因在DC内的持续表达而延长抗原呈递作用；另一方面腺病毒载体本身还有佐剂样作用，本研究证实空载腺病毒Ad转染DC有一定的促Th1极化功能，由此腺病毒载体可能起到佐剂的作用，辅助MOMP抗原充分激活DC的功能，诱导强的抗衣原体Th1反应。本研究符合以往腺病毒介导基因修饰DC的免疫效果强于相应蛋白直接冲击DC的结论。此外，MOMP的多态性是否导致E型MOMP与MoPn MOMP对DC功能影响的差别，尚需实验进一步证实。本研究有助于确定MOMP导入DC的最佳方式，并为衣原体性病的免疫治疗提供有价值的理论依据及临床应用基础。四．衣原体密码偏爱性分析近年来优化密码成为有效改善疫苗效果的重要策略之一。优化密码，即用宿主基因组偏爱密码取代异源基因的相应密码，可以使原本在宿主体内低表达的异源基因表达水平明显提高，从而增强该异源基因的免疫原性。同时在以上研究中我们观察到，重组质粒pVAX1-MOMP转染COS-1细胞后MOMP的表达较弱，重组腺病毒Ad-MOMP感染293细胞及DC后MOMP的表达也不是很强，提示Ct蛋白可能并不适合在哺乳动物中表达，对MOMP基因进行修饰可能增强重组腺病毒Ad-MOMP及其转染DC的免疫效果。为探索优化密码的策略增强MOMP重组腺病毒免疫原性是否具有可行性，本研究利用DNAStar、EMBOSS、codon usage database等数据库及生物信息学软件，对不同种及亚种的衣原体(包括鼠肺炎衣原体，人沙眼衣原体，肺炎衣原体和鹦鹉热衣原体)基因组密码子使用特点进行了全面分析，发现了有价值的信息：1．不同种及亚种的衣原体存在共同的密码子使用规律，偏爱使用第三位碱基上为A或T的密码子。在T或A结尾的密码子中，衣原体偏好使用A、T含量高的密码子。2．不同种及亚种的衣原体密码子使用各有其自身特点，其中C．psittaci对偏爱密码的偏爱程度最大。衣原体与人类基因组密码使用差异较大，与人相比，不同种类衣原体的偏爱密码并不完全相同。3．感染人的Ct与酵母的密码子偏爱性较为一致，而与大肠杆菌、腺病毒和人类细胞的密码子偏爱性差别均较大。以上结果提示：①不同种及亚种的衣原体密码子使用频率既有共性，也有个性，在考虑具体的优化措施时应区分不同的衣原体种或亚种，对研究对象进行具体的分析，以更准确的反映其个性特征。②酵母系统可能比较适于Ct基因表达。③Ct的密码子使用倾向与腺病毒及人类细胞不同，可能是限制MOMP基因重组腺病毒及重组质粒在哺乳动物细胞中高效表达的原因之一。对Ct的抗原基因进行改造修饰可能是提高Ct疫苗免疫原性的有效策略。同时我们分析得出腺病毒与其宿主人类细胞密码使用相似，按照人类细胞的优势密码子来优化MOMP基因是可行的。今后我们将用实验来验证这一点。本研究为进一步设计高表达的E型MOMP基因、增强MOMP基因重组腺病毒的免疫原性奠定基础，同时也为肺炎衣原体、鹦鹉热衣原体等基因的改造提供重要信息。