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目的:构成乙型肝炎病毒基因组的4个读码框是重叠开放的,各自编码一种蛋白。其中X基因重叠包绕启动子与增强子2,前核心区和核心区域的转录作用受以上两个因子控制。由于乙型肝炎病毒聚合酶的校对缺陷,导致乙型肝炎病毒DNA容易发生突变。HBV基因型和病毒DNA载量均和乙肝相关性肝细胞肝癌的发病相关联,除此之外,前S1、前S2、BCP和增强子2区域的基因突变也参与到乙肝相关性肝细胞肝癌的风险的病例对照研究中。有研究表明这上述区域中的几种基因突变与肝细胞癌的发展存在相关性。然而,目前只有少数针对乙肝相关性肝细胞肝癌患者中上述基因突变的预后价值的研究,尤其针对HBX基因区域。通过测定肝组织样本中乙型病毒性肝炎DNA,Yeh等人发现核心启动子组分A1752T/1764A的突变是肝细胞癌患者术后预后的独立预测因子。在当前的研究中我们通过利用来自乙肝相关性肝细胞肝癌患者肝癌组织样本中的乙肝病毒DNA测定出乙型肝炎病毒X的基因序列,并用该序列来鉴定识别与术后生存相关的基因突变序列。方法:1研究对象及随访:选取2007-2009两年间在河北医科大学第四医院肝胆外科行肝癌切除术的患者,通过影像学检查、组织病理明确诊断为肝细胞肝癌。采集肝细胞癌患者术中切除的肝癌组织标本,并准确记录所有患者的性别、年龄、肿瘤大小、TNM分期、Child分级等临床特征。通过门诊复查、电话等方式随访肝癌患者术后的生存情况,随访时间截止到2014年12月。2基因组DNA提取、扩增及测序:用DNA纯化试剂盒提取肝癌组织标本的基因组DNA,鉴定合格后,采用PCR技术扩增目的片段,设计两对引物对目的片段进行扩增,引物分别为:HBV1F:5’-ATGCGTGGAACCTTTGTG-3’,HBV1R:5’-TCGGTCGTTGACATTGCT-3’;HBV2F:5’-CACCTCTGCACGTAGCAT-3’,HBV2R:5’-TCCCATACAGAGCAGAG-3’。扩增所得DNA产物通过琼脂糖凝胶电泳检测证实后送测序,每个标本选用双向重复测序。3统计分析:单因素分析中使用Kaplan-Meier的方法来生成生存曲线,曲线之间的比较所用的方法是对数秩检验。多因素分析采用Cox风险回归模型。实验数据均采用SPSS13.0软件进行统计学分析,P<0.05被认为有统计学意义。结果:1乙肝相关性肝细胞肝癌患者的一般特征。本研究包括总共106例乙肝相关性肝细胞肝癌患者,对这些患者每3个月进行一次随访,随访时间3年。其间有7例患者失去联系,失访率低于20%,对分析研究无影响。将上述肝癌DNA从肝细胞癌组织中提取用于病毒学分析,平均乙肝病毒DNA水平是5×109±2.616×1010复制量/微克,其中最大复制量1.97×1011,最小复制量1.39×104。经DNA序列测定,本研究发现在HBV X区域存在114个核苷酸突变。检测发现突变率最高的位点是1386核苷酸位点,有74例患者存在此突变。经统计学相关性分析,乙肝病毒DNA复制水平与基因突变数量并无相关性(P=0.146)。2本研究选择携带B型或C型乙肝病毒基因型的共94例肝细胞肝癌术后患者进行生存分析。选择可能影响术后生存率的临床特征(性别、年龄、肿瘤数目、Child分级、基因型、肿瘤大小、TNM分期、门脉瘤栓)进行单因素分析。结果显示,肝细胞癌术后男性与女性的3年生存率比较无差异(P=0.415);年龄分组以55岁为界限,比较≤55岁与>55岁两组的3年生存率无统计学意义(P=0.324);肝细胞癌患者的肿瘤数目(单发与多发,P=0.922)、Child分级(A与B,P=0.446)、TNM分期(Ⅰ期与Ⅱ期+ⅢA期+ⅢB期,P=0.227)与患者术后生存时间无关。然而,肿瘤大小(≤55与>55岁,P=0.016)、门脉瘤栓(有与无,P=0.001)与这些患者的术后生存率相关联。经过DNA测序,统计发生突变的核苷酸位点,发现高于5%突变率的突变位点总共有21个,这些位点用于生存分析研究。在21个突变位点中,经过秩检验和Kaplan-Meier法分析,以下7个位点突变在统计学重要水平上影响肝癌术后生存率:1383,1461,1485,1544,1613,1653和1762。基于Cox比例风险模型的多变量生存分析,结果表明门脉瘤栓是乙肝相关性肝细胞肝癌患者术后生存率的独立影响因素。在突变位点中,以下4个突变位点是乙肝相关性肝细胞肝癌患者术后生存率的独立影响因素:1461(相关风险(RR)3.162,95%置信区间(CI)1.319-7.582,P=0.010),1485(RR 1.989,95%CI 1.054-3.751,P=0.034),1544(RR 2.602,95%CI 1.040-6.513,P=0.041),1653(RR 2.652,95%CI 1.184-5.938,P=0.018)。3病毒学参数与肝癌病人术后生存率的相关性病毒学因素中,患者的基因型、HBV DNA复制水平、E抗原状态和突变数目通过Kaplan-Meier生存分析法进行比较,结果显示:HBV DNA复制水平(<6.0E+08与≥6.0E+08,P=0.061)与肝癌患者术后生存率的关系在重要水平的临界线上,而患者的基因型、E抗原状态、突变数目与肝癌患者术后生存时间不相关。结论:我们研究的HBV X基因的4个核苷酸位点突变:1461、1485、1544、1653是乙肝相关性肝细胞肝癌患者术后生存率的独立影响因素。在临床特征中,门脉瘤栓是乙肝相关性肝细胞肝癌患者术后生存率的独立影响因素。