【摘 要】
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目的:骨肉瘤（Osteosarcoma,OS）是临床上最常见的原发性恶性骨肿瘤。已知c GMP依赖性蛋白激酶II（c GMP dependent protein kinase II,PKG II）是一种具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性的膜结合酶,可抑制多种肿瘤细胞生长。本研究通过体外及体内实验,系统地探讨PKG II在骨肉瘤中的作用,并探索潜在作用机制。方法:（1）通过实时荧光定量PCR法和West
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目的:骨肉瘤（Osteosarcoma,OS）是临床上最常见的原发性恶性骨肿瘤。已知c GMP依赖性蛋白激酶II（c GMP dependent protein kinase II,PKG II）是一种具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性的膜结合酶,可抑制多种肿瘤细胞生长。本研究通过体外及体内实验,系统地探讨PKG II在骨肉瘤中的作用,并探索潜在作用机制。方法:（1）通过实时荧光定量PCR法和Western Blotting,检测PKG II在三种人骨肉瘤细胞系和正常人成骨细胞系中的表达水平。（2）使用c GMP处理骨肉瘤细胞,激活内源性的PKG II,利用细胞计数试剂盒-8和平板克隆形成实验,检测内源性PKG II对骨肉瘤细胞增殖活性的影响,利用细胞划痕实验和Transwell侵袭实验探究其对迁移和侵袭活动的影响。（3）利用腺病毒载体构建PKG II过表达细胞系,通过Western Blotting验证过表达效果,检测PCNA、MMP-2、MMP-13的表达情况,利用功能学实验,检测过表达PKG II对EGF刺激引起的增殖、迁移和侵袭活动的影响。（4）利用转染稳定转染PKG II的骨肉瘤细胞系,接种于裸鼠右侧背部皮下,构建裸鼠皮下异种移植骨肉瘤模型,测量小鼠体重改变及肿瘤的大小和重量,收集裸鼠外周血,利用酶联免疫吸附试验法测定血红蛋白的水平。（5）利用转染稳定转染PKG II的骨肉瘤细胞系,接种于裸鼠左侧胫骨骨髓腔,构建裸鼠原位移植骨肉瘤模型,测量小鼠体重改变及肿瘤的大小和重量,收集裸鼠外周血,利用ELISA检测碱性磷酸酶的水平。利用micro CT和苏木精-伊红染色法观察原位移植瘤的骨质破坏和肿瘤浸润情况。利用免疫组化检测肿瘤组织中PKG II的表达情况;（6）构建裸鼠原位移植瘤模型中,利用HE染色检测新生血管生成情况,利用IHC法检测肿瘤组织中CD105的表达水平;（7）在MNNG/HOS骨肉瘤细胞系中转染PKG II,利用EGF刺激骨肉瘤细胞,使用Western Blotting检测EGFR相关信号通路中VEGFR2、EGFR、p-EGFR,JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3的蛋白表达水平。利用IHC检测原位移植瘤模型中肿瘤组织EFGR的表达水平。结果:（1）PKG II在人骨肉瘤细胞系中的m RNA和蛋白都处于低表达;（2）活化的内源性PKG II显著降低人骨肉瘤细胞的增殖活性、迁移和侵袭活动;（3）成功构建PKG II过表达的稳转株,经过EGF刺激,骨肉瘤细胞中PCNA、MMP-2和MMP-13的水平显着提高,而过表达并激活PKGⅡ可减少EGF刺激引起的PCNA、MMP-2、MMP-13表达的增加。经EGF刺激后,骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力显着增强,过表达并激活PKG II,可显著减弱由EGF刺激引起的骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭活性;（4）过表达PKG II可显著抑制裸鼠皮下移植瘤和原位移植瘤的生长、骨质破坏和血管生成;（5）PKG II组中p-EGFR,p-JAK2和p-STAT3的蛋白表达明显降低,肿瘤组织中的EFGR表达明显较低。结论:（1）PKG II在人骨肉瘤细胞系中处于低表达水平,可显著抑制EGF刺激引起的骨肉瘤增殖、迁移、侵袭和血管生成等恶性生物学行为的增加。（2）在体内,PKG II显著抑制骨肉瘤的生长、骨质破坏和新生血管的生成。（3）该机制可能是通过抑制EGFR的激活及其下游JAK2/STAT3的磷酸化来实现的,这些研究发现有望为阐明骨肉瘤发生带来新的见解,并为其分子治疗提供潜在靶标。
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