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四氧化三铁纳米颗粒（Fe3O4 nanoparticles,Fe3O4-NPs）是目前应用广泛的磁性纳米颗粒,具有较好的生物相容性,因而常应用于体内磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging,MRI）的成像剂、药物载体以及在交替磁场作用下产热进行癌细胞杀伤等。Fe3O4-NPs可以模拟辣根过氧化物酶催化活性,机制可能是Fe3O4-NPs表面的Fe2+/Fe3+催化过氧化氢（H2O2）分解为羟自由基。而铁死亡（Ferroptosis）是铁依赖性活性氧（reactive oxygen species,ROS）的异常堆积而导致氧化还原平衡失调的细胞死亡方式。细胞铁死亡是通过胞内H2O2在内源性Fe2+/Fe3+的催化下形成活性氧自由基（OH）,这与Fe3O4-NPs的过氧化物酶活性类似。双氢青蒿素（Dihydroartemisinin,DHA）分子结构中有过氧桥键,具有被金属离子（Fe2+/Fe3+、Mn2+、Cu2+等）催化生成·OH的潜质,可以诱导肿瘤细胞铁死亡发挥抗肿瘤活性,而配合铁剂可以增加DHA抗肿瘤特性。本研究包括以下内容:（1）探讨Fe3O4-NP诱导巨噬细胞铁死亡及其机制;（2）探讨Fe3O4-NPs促进DHA的抗肿瘤活性,并构建细胞载体进行Fe3O4-NPs和DHA两种纳米粒子的靶向递送;（3）探讨Fe3O4-NPs+DHA-LPs@Ana-1细胞载体的体内的靶向递送作用,通过细胞载体靶向递送Fe3O4-NPs和DHA进行联合治疗抗肿瘤作用。第一部分Fe3O4-NPs通过p53诱导巨噬细胞铁死亡目的:探索Fe3O4-NPs作用后对巨噬细胞活性的影响及机制。方法:（1）合成Fe3O4-NPs,采用TEM,SEM和马尔文粒径仪进行表征;（2）CCK-8测定Fe3O4-NPs作用24h和48 h对巨噬细胞活性影响,WB,RT-qPCR和Elisa检测Fe3O4-NPs作用后Ana-1和TAMs的表型变化;ICP-AES,普鲁士蓝染色和溶酶体探针对胞内Fe3O4-NPs定量和定位;（3）RNA测序结果显示48 h组铁死亡通路活化;未验证是否发生铁死亡,Erastin处理的巨噬细胞作为铁死亡阳性对照,WB测定各组p53、xCT、GPX4、TFR的蛋白水平变化;TEM观察各组细胞超微结构变化情况;（4）采用DCFH-DA探针和JC-1染色测定24 h和48 h组线粒体膜电位变化情况和胞内ROS含量是否与作用时间相关;（5）测定24 h,48 h组和Ferrostatin-1与Fe3O4-NPs共同作用组的GSH和GSSG含量,观察Ferrostatin-1对其是否有抑制作用;（6）Pifithrin-α与Fe3O4-NPs共同作用后,AM/PI测定其对细胞活性影响;免疫荧光染色及WB测定其对蛋白表达影响及GSH/GSSG比率的影响。结果:（1）表征结果显示,Fe3O4-NPs粒径为100nm,有较好的分散性和稳定性;（2）Fe3O4-NPs作用时间延长后巨噬细胞活性降低,并诱导Ana-1和TAMs向M1表型极化。胞内铁定量结果显示Fe3O4-NPs作用于巨噬细胞8 h后胞内铁含量不再增加,由此可知48 h组细胞活性下降与胞内铁的量无关,可能与Fe3O4-NPs作用时间相关;定位结果显示Fe3O4-NPs吞噬至溶酶体中;（3）RNA测序结果显示,48 h组铁死亡通路激活伴随p53表达水平增高。巨噬细胞中TFR,p53,xCT,GPX4的表达水平与Erastin处理的巨噬细胞表达一致,48 h组线粒体超微结构损伤与Erastin组形态相似,提示Fe3O4-NPs作用巨噬细胞48 h后可能导致细胞铁死亡;（4）胞内ROS含量增加和线粒体膜电位的下降与Fe3O4-NPs作用时间呈正比,说明Fe3O4-NPs导致细胞内氧化应激反应增加及线粒体损伤,且呈时间依赖相关性;（5）铁死亡抑制剂Ferrostatin-1抑制48 h组GSH/GSSG比率下降,减轻细胞内氧化应激作用,Fe3O4-NPs导致巨噬细胞发生铁死亡。（6）P53抑制剂Pifithrin-α作用后,抑制Fe3O4-NPs的细胞毒性,降低p53表达同时抑制TFR表达水平和GPX4蛋白消耗,也抑制GSH/GSSG比率下降,降低胞内的氧化应激反应。p53可能参与介导Fe3O4-NPs诱导的巨噬细胞铁死亡。结论:Fe3O4-NPs诱导巨噬细胞铁死亡,且p53可能参与介导此过程。第二部分构建介导Fe3O4-NPs与DHA-LPs靶向递送的巨噬细胞载体目的:构建搭载Fe3O4-NPs和DHA的载体细胞,探讨巨噬细胞作为载体细胞的靶向能力。方法:（1）乙醇注入法合成DHA-LPs,TEM和马尔文粒径仪进行脂质体的粒径、形态和稳定性表征并测定其包封率,检验是否为合格的脂质体;（2）采用CCK-8实验建立DHA对LLC细胞的IC50曲线,AM/PI染色观察Fe3O4-NPs是否可以促进DHA的细胞杀伤作用;（3）流式细胞术检测吞噬Fe3O4-NPs和LPs最大细胞数量的时间点;ICP-AES和酶标仪测定Ana-1细胞吞噬Fe3O4-NPs和LPs的最大量的时间点;荧光显微镜进行Fe3O4-NPs和LPs的胞内定位;CCK-8实验测定6h内Fe3O4-NPs和LPs对细胞活性的影响;（4）分光光度计检测DHA-LPs在模拟溶酶体PH值的PBS中的释放;Fe3O4-NPs+DHA-LPs@Ana-1细胞与LLC细胞共培养24 h,CCK-8测定LLC细胞活性,观察细胞载体是否吞噬足够量的DHA和Fe3O4-NPs进行LLC细胞杀伤;（5）培养LLC细胞3D肿瘤球与Fe3O4-NPs+DHA-LPs@Ana-1共同培养18h,用共聚焦显微镜观察并计算穿透指数检测载体细胞的穿透能力。结果:（1）合成DHA-LPs后测定包封率均在85%以上,且形状为规则圆形,双囊状,粒径170-190nm左右,可以被细胞吞噬;（2）DHA的半数致死量8.5162 μg/mL,Fe3O4-NPs与DHA共同作用于LLC细胞可以增强DHA的细胞杀伤作用;而6 h内吞噬Fe3O4-NPs和LPs的细胞数量达到91%以上,且胞内的Fe3O4-NPs和LPs分别在作用2 h和6 h后达到最大值,说明Fe3O4-NPs和LPs作用于Ana-1细胞6 h后是构成Fe3O4-NPs+DHA-LPs@Ana-1细胞载体的最佳时间点;荧光显微镜下可以观察到Fe3O4-NPs和LPs共定位到巨噬细胞内;（3）DHA-LPs在48h内释放量达到 80%;Fe3O4-NPs+DHA-LPs@Ana-1 与 LLC 细胞共培养后,LLC细胞活性明显降低,表明Fe3O4-NPs+DHA-LPs@Ana-1吞噬足够量DHA进行肿瘤细胞的杀伤;（4）共聚焦显微镜和倒置显微镜观察3D肿瘤球穿透实验,Fe3O4-NPs+DHA-LPs@Ana-1有较好的趋向性及穿透能力进行靶向递送。结论:Ana-1能够搭载DHA和Fe3O4-NPs,并保持较好的细胞活性及趋向性,进行靶向递送及杀伤肿瘤细胞的作用。第三部分Fe3O4-NPs+DHA-LPs@Ana-1细胞载体在小鼠原位肺癌的靶向作用及抗肿瘤作用目的:研究Fe3O4-NPs+DHA-LPs@Ana-1的体内靶向递送作用,以及Fe3O4-NPs和DHA通过协同作用在体内发挥抗肿瘤效果。方法:（1）构建C57BL/6小鼠原位肺癌模型,小动物成像观察小鼠的成瘤情况;（2）模型小鼠静脉注射细胞载体24 h后,取各脏器进行冰冻切片,荧光显微镜观察和 ICP-AES 测定由 Fe3O4-NPs+DiO-LPs@Ana-1 递送的 Fe3O4-NPs 和 DiO-LPs在各脏器的分布情况;（3）模型小鼠给药治疗结束后肿瘤的生长情况及HE染色观察各脏器和肿瘤细胞形态变化。结果:（1）术后7天,小动物成像观察结果显示小鼠成瘤率100%;（2）模型小鼠静脉注射Fe3O4-NPs+DiO-LPs@Ana-1通过冰冻切片观察,发现与DiO-LPs相比,细胞载体组的LPs在肿瘤组织中的含量明显增加;ICP-AES进行组织铁定量,细胞载体组的肿瘤组织铁含量较Fe3O4-NPs组明显增加;（3）治疗结束后,Fe3O4-NPs+DHA-LPs@Ana-1组的模型小鼠的肿块体积明显较小,未见对侧转移等情况;HE染色显示治疗组肿瘤细胞出现部分类似凋亡细胞形态,而大部分肿瘤细胞出现缺乏染色质凝集等类似铁死亡形态。结论:Fe3O4-NPs+DHA-LPs@Ana-1可以作为细胞载体进行Fe3O4-NPs和DHA的靶向递送,Fe3O4-NPs和DHA具有协同作用发挥体内治疗肺癌作用,其机制需进一步研究。