背景：骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是具有高度自我更新能力和多向分化潜能的多能干细胞,可被诱导分化成成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞、神经细胞等[1]。间充质干细胞作为骨髓微环境的重要成分,不仅有分化成成骨细胞、脂肪细胞等骨内成分,且有支持造血的功能[2],与内皮细胞、巨噬细胞、网状细胞等基质细胞也有紧密联系,无疑对骨髓中造血细胞龛位的健全和脂肪化问题的解决有重要作用。重型再生障碍性贫血(severe aplastic anemia,SAA)中免疫异常[3],红骨髓总容量减少,代以脂肪髓,造血微环境异常[4],因此评价SAA的治疗药物对骨髓间充质干细胞的影响显得尤为重要。雷帕霉素(Rapamycin)是一种新型大环内酯类免疫抑制剂,阻断T淋巴细胞G1期至S期的进程,从而发挥免疫抑制效应。从临床应用来看,雷帕霉素应用于临床上器官移植的抗排斥反应和自身免疫性疾病的治疗,它的免疫抑制活性比临床广泛使用的环孢素强数十倍,毒性低,且与环孢素有良好的协同作用,因此有人假设,将Rapamycin加入再生性障碍性贫血的用药方案,使得其与环孢素协同并互补地作用于T细胞活性的抑制,可能会提高重型再生性障碍性贫血的治疗疗效。但也有相关报道称雷帕霉素不能提高初诊SAA患者的生存率,但在部分难治及复发SAA的治疗中有效。所以就雷帕霉素是否临床上应用于重型再生性贫血的治疗仍存在异议。目的：难治及复发SAA的挽救性药物治疗策略为当前骨髓衰竭研究领域的热点及难点,有研究表明,部分难治及复发SAA的mTOR信号异常活化,雷帕霉素不仅是一种新型大环内酯类免疫抑制剂,也为mTOR抑制剂。本研究旨在探讨雷帕霉素对难治及复发SAA患者的骨髓间充质干细胞凋亡、细胞周期、增殖、免疫与成脂分化等生物学功能的影响,并对各现象进一步探讨是否和同时作为自噬激活剂的雷帕霉素抑制mTOR通路有关。为研究雷帕霉素应用于临床上SAA的治疗提供一定的实验资料。方法：(1)在诱导体系中,定向诱导患者骨髓间充质干细胞向脂肪细胞、成骨细胞分化,用油红O染色和茜素红分别观测脂滴形成、钙盐沉积情况以鉴定其多向分化潜能。(2)不同浓度雷帕霉素(0、10、50、100nmol/L)处理细胞48h后,应用流式细胞仪检测细胞凋亡率,并用Real-time PCR方法检测抗凋亡基因Bcl-2与凋亡相关基因Bax的表达。(3)应用流式细胞仪检测雷帕霉素对SAA细胞周期的影响,并用Real-time PCR方法检测细胞周期调控因子p21基因的表达。(4)采用CCK-8试剂盒检测药物处理后的细胞增殖情况(5) SAA-MSC经不同浓度雷帕霉素预处理后,体外建立难治与复发性SAA-MSC和人外周血单个核细胞的共培养体系,用酶联免疫吸附试验试剂盒检测其IFN-γ的分泌水平。(6)在含不同浓度雷帕霉素的诱导体系中,定向诱导SAA-MSC向脂肪分化2周后,用油红O染色观测脂滴形成情况,并用Real-time PCR方法检测成脂分化标志蛋白(LPL、CFD和PPARγ)的表达。(7)透射电镜观察难治与复发SAA-MSC于雷帕霉素处理后的自噬体形成情况,不同浓度雷帕霉素(0、10、50、100nmol/L)处理再障骨髓间充质干细胞48h,Western blot检测自噬相关蛋白LC3B的表达。(8)不同浓度雷帕霉素处理细胞48h,Westernblot检测mTOR蛋白的表达,并用Real-time PCR检测mTOR下游通路基因4EBP1和p70S6K的表达。结果：(1)难治与复发重型再生障碍性贫血骨髓间充质干细胞具有间充质干细胞的表面标志,并且具有多向分化能力。(2)雷帕霉素促使SAA-MSC凋亡并且抗凋亡基因Bcl-2降低,凋亡相关基因Bax的表达增高。(3)雷帕霉素呈剂量依赖性地将细胞阻滞于Go/G1期,阻止其进入S期(P<0.05),细胞周期调控因子p21基因的表达相应增高。(4)增殖率随雷帕霉素浓度增加而降低。(5)雷帕霉素不影响SAA-MSC抑制单个核细胞分泌IFN-γ的水平。(6)雷帕霉素抑制再障骨髓间充质干细胞的成脂分化,且呈剂量依赖型地降低成脂相关基因(LPL、CFD和PPAR)γ的表达。(7)透射电镜观察难治与复发SAA-MSC于雷帕霉素处理后有明显的自噬体形成,且自噬相关蛋白LC3B的表达随雷帕霉素浓度的升高而增加(8)药物处理后,mTOR蛋白的表达受抑制,mTOR下游通路基因4EBP1和p70S6K的表达也受抑制。结论：雷帕霉素诱导再障骨髓间充质干细胞凋亡,明显促进G1期细胞周期阻滞,抑制细胞增殖和降低成脂分化,以上现象的机制可能均与雷帕霉素通过抑制mTOR信号通路而激活自噬有关。