丹参Salvia miltiorrhiza Bunge作为我国传统中药，很早就见载于《神农本草经》，具有祛瘀止痛，活血通经，凉血消痈，清心除烦之功，常用于心血管系统和血液系统等疾病的治疗。丹参主要含有脂溶性的二萜醌类化合物(丹参酮类成分)和水溶性的酚酸类化合物，均具有较强的药理活性。本实验将主要集中于丹参酮类成分方面的研究。由于不同地区丹参药材质量差别大，栽培丹参的生长周期长且有效成分含量低等缺点，临床疗效得不到可靠保证。而植物人工组织和细胞培养正好可以解决传统农业的不足，被认为是替代传统农业生产植物目的次生代谢产物理想途径。这其中由发根农杆菌Agrobacterium rhiyogenes诱导产生的毛状根培养系统，由于在生产植物次生代谢产物方面具有遗传稳定、不需要添加激素、持续稳定的生产次生代谢产物的能力等优势而成为丹参次生代谢工程的理想操作平台。在丹参毛状根培养系统的研究中，提高有效成分的含量一直是人们追求的目标。采用诱导子方法促进丹参次生代谢从而提高有效成分积累是一条行之有效的途径。这方面报道较多，主要集中在培养条件的优化、诱导子的筛选、丹参有效成分含量测定等方面，而关于丹参有效成分次生代谢，诱导子作用机制的分子水平研究等鲜见报道。由于丹参基因序列信息特别是功能基因的信息很少，给丹参有效成分次生代谢的基因水平研究带来了巨大困难。GenBank蛋白数据库中仅见有15条丹参蛋白质序列，在这些报道的蛋白中，与丹参酮类成分代谢途径相关的酶蛋白就更少，此外，丹参酮类成分次生代谢在GGPP以下的下游代谢途径目前还未知。为此，要克隆丹参酮类成分代谢相关的诸多未知基因，正确的思路和技术方法是保证成功的关键。在清楚了解研究目的和研究重点的前体下，在丹参功能基因研究基础比较薄弱的情况下，本实验以丹参基因芯片为技术平台，以差异克隆为基本思路，克隆得到了多个与丹参酮类成分次生代谢相关的基因。在综合分析这些基因代谢通路的基础上，首次通过实验初步推导出了丹参酮类成分的大致代谢途径，特别是二萜代谢途径中GGPP代谢以下的关键酶基因，二萜环化酶基因的成功克隆及表达分析，为丹参酮类成分次生代谢途径的研究推进了一大步，进而为实现丹参有效成分的基因调控，丹参基因工程等研究奠定了基础。主要研究结果如下：1归纳发展了表型克隆方法—成分差异表型克隆(Ingredient difference phonetypiccloning)法。所谓“成分差异表型克隆法”是基于植物次生代谢产物的差异(包括某类成分含量差异和某些成分的有无)为表型特征，运用差异表达基因克隆技术来获取次生代谢相关基因的一种克隆思路和方法，属于表型克隆的范畴。该方法特别适合次生代谢未知功能基因的克隆，本实验通过该方法克隆得到了1个与丹酚酸类成分生物合成相关基因和5个丹参酮类成分生物合成相关基因。2采用HPLC的方法研究了诱导子组合YE+Ag~+及MJ对丹参毛状根次生代谢产物丹参酮类成分积累的影响。(1)研究结果表明YE+Ag~+能有效促进丹参酮类成分的快速积累，获得了研究的第一手资料，为后续的即芯片杂交样本的处理和选择提供了实验依据。(2)本实验首次将茉莉酸甲酯(MJ)作为诱导子应用于丹参的毛状根培养实验中。证明了MJ能有效提高丹参酮类成分在丹参毛状根中的积累并刺激其向培养基中释放。这为后续cDNA芯片结果的验证及丹参次生代谢关键酶基因的功能分析提供了实验参考。3通过丹参cDNA芯片杂交，根据杂交结果ratio值数据，进行Cluster聚类分析和t检验，筛选出了基因表达差异显著的克隆。然后进行电子拼接、BLASTX功能注释、KOBAS和KEGG代谢途径分析等，获得了诱导子YE+Ag~+处理丹参毛状根48h时的差异基因转录谱。根据转录谱的信息，筛选了5个与丹参酮类成分次生代谢密切相关的基因和1个酚酸类代谢相关基因，为cDNA全长的克隆、代谢途径的研究等奠定了基础。4根据芯片筛选的关键差异基因片段，成功克隆了丹参6个基因的全长cDNA序列，它们分别是：①丹参乙酰CoA酰基转运酶(SmAACT)、②丹参4-(5’-焦磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶(SmCMK)、③丹参异戊烯基焦δ异构酶(SmIPPI)、④丹参法呢基焦磷酸合酶(SmFPPS)、⑤丹参内根-贝壳杉烯合酶(SmKS)，⑥丹参4-香豆酸-CoA连接酶(Sm4CL)，并就这些基因进行了序列的测定，其中Sm4CL(与丹酚酸类成分生物合成有关)未进行深入研究。5根据全长cDNA序列，通过翻译的氨基酸序列分析了其中①～⑤共5个与丹参酮类成分代谢相关酶的分子特性，包括蛋白质氨基酸序列开放读码框分析、功能位点分析、疏水性分析、二级结构预测、三维结构同源建模分析、同源性分析、分子进化树分析以及代谢途径分析等详细的蛋白分子特征信息分析。为进一步的基因功能研究及丹参酮类成分次生代谢途径的推导等奠定了理论基础。6建立了SYBR荧光实时定量PCR的检测方法，分析了基因在丹参毛状根中经诱导子处理后不同时期的表达情况，其结果证实了芯片实验结果的可靠性和与丹参酮类成分生物合成的相关性。(1)通过对丹参毛状根诱导子YE+Ag~+处理后不同时期各关键基因的表达分析，成功验证了cDNA芯片杂交结果的正确性和可靠性，为进一步挖掘诱导子转录谱信息，分析丹参时空表达特性等奠定了基础，提高了芯片结果的可信度。(2)通过茉莉酸甲酯(MJ)对丹参毛状根处理后不同时期基因表达分析，初步探讨分析了丹参酮类次生代谢相关基因的功能，从而为丹参酮类成分的生物合成途径的初步推导奠定了基础。7通过丹参次生代谢途径中相关酶基因的克隆和表达分析，首次通过实验初步推导出了丹参酮类成分的次生代谢途径。总之，通过对诱导子处理后的丹参毛状根差异表达基因的筛选，克隆得到了多个与丹参次生代谢途径密切相关的基因。通过该研究，实践了“成分差异表型克隆”的思路和方法，证明了该研究方法的可行性。同时，对所克隆基因相关代谢途径分析和基因表达分析初步推导出了丹参酮类成分的次生代谢途径，为实现丹参有效成分代谢工程的基因调控、功能基因组学研究、丹参药材的分子标识及丹参道地药材形成机制的分子诠释等奠定了基础。