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目的：分析近10余年我国人间布鲁氏菌病实验室检测方法的使用现状,并对其敏感度和特异度进行评价；对三种原理不同的核酸提取方法提取核酸的效率及产物质量进行比较；建立布氏菌荧光定量PCR及布氏菌含量的计算方法,探索应用于布鲁氏菌病诊断的可行性；为《布鲁氏菌病诊断标准》的修订提供技术支持。方法：按“布鲁氏菌病／布病”和“实验室检查／诊断方法”关键词组合,在万方数据知识服务平台、中国知网、中文期刊数据库(维普)等中文数据库中检索2004-2014年间有关布病实验室检测的文献。统计各省份各检测方法的检测样本量和各检测方法的灵敏度、特异度及符合率。分别采用离心柱法(以TIANGEN细菌基因组提取试剂盒为代表)磁珠法(以Taco全DNA萃取试剂盒为代表)及水煮法提取浓度分别为1011、1010.5、1010、109.5、109 CFU/ml的布氏菌1 6M菌液,分别以50 μl、100 μl、200 μl(水煮法无洗脱步骤,不区分)的洗脱体积收集产物；用Nanodrop ND-1000分光光度计测量所提取核酸的浓度及纯度等指标,并检测各方法提取的核酸能否进行PCR及荧光定量PC。用平板计数确定布氏菌浓度,用此菌液建立PCR及荧光定量PCR的检测方法,及通过荧光定量PCR推算临床标本布氏菌浓度的参考系。并比较生理盐水菌液与血清模拟样本对荧光定量PCR检测结果的影响,比较不同目的基因引物进行普通PCR的检测下限差异。结果：1.筛选得到检查样本数量及方法相关文献共157篇,其中实验室检查方法准确性相关文献共22篇。由24个省份报告,实际样本检测时间为1954-2012年,共使用14种方法检查了716280份样本。2.检测方法中,检测样本量由大到小为试管凝集试验(SAT,256050份),虎红平板凝集试验(RBT,224699份),皮肤过敏试验(184787份),平板凝集试验(PAT,33018份)等。3.24个省使用SAT,20个省使用RBT,10个省使用皮肤过敏试验,7个省分离布氏菌；检测样本量由大到小为河南(114031份)、内蒙古(104287份)、浙江(93484份)；使用的检测方法由多到少为浙江(9种)、内蒙古(7种)、山东和黑龙江(5种)。4.各检测方法与SAT的符合率最高的是胶体金,为99.77%(9811/9834)；其次为PAT,为97.73%(86/88)；双抗原夹心酶联免疫吸附试验(DAgS-ELISA),96.49%(110/114);RBT,94.55%(2 465/2 607)；人免疫球蛋白G酶联免疫吸附试验(IgG ELISA),86.38%(2068/2394);IgM ELISA,76.23%(1 825/2394);补体结合试验(CFT),69.17%(83/120)；皮肤过敏试验,56.36%(31/55)。5.在获得核酸的产量上,离心柱法和磁珠法都远低于水煮法,而离心柱法稍高于磁珠法。离心柱法和磁珠法在菌液浓度1011～1010.5CFU/ml可得到最高浓度的产物,水煮法所得产物浓度随着菌液浓度的升高呈线性增加。离心柱法中,核酸浓度随洗脱体积的增加而减少,但对总产量的影响不大,故洗脱体积在50 μ 1～200 μ 1范围内均可。磁珠法随着洗脱体积的增加,核酸浓度下降得更快,即在50μ1时,总产量最高,2001x1时总产量最低。6.在纯度上,水煮法最高(A260/A280、A260/A230比值最接近核酸对应的标准范围),离心柱法其次,磁珠法最低。7.三种方法重复性都很好,结果稳定；且PCR和荧光定量PCR结果均为阳性。8.以b csp31作为目的基因,在108,～103CFU/ml范围内可得到荧光定量PCR典型扩增。Ct值在108～103CFU/ml范围内与菌液浓度的对数值呈线性,标准曲线,y=-3.0574x+46.171,R2=0.9968。9.生理盐水菌液与血清模拟样本荧光定量PCR的检测下限相同,为103CFU/ml,各浓度Ct值没有显著差异。用B4/B5对两种样本进行普通PCR,检测下限也相同,为106CFU/ml。10.用IS313/IS639、brucl/bruc5分别检测菌液样本。IS313/IS639检测下限为105 CFU/ml,brucl/bruc5的检测卜限为10CFU/ml。结论：1.SAT的应用范围最广,此次研究所涉及的24个省份都采用了,且检测样本量也是最大。RBT的检测样本量及使用省份其次,且灵敏度特异度均达到94%以上。2.近十年,皮肤过敏试验和PAT的使用单位相对RBT较少,检查样本量也小,分别为184787份及33018份。3.CFT、抗人免疫球蛋白试验(Coomb’s)操作繁琐,使用范围小,CFT仅一个省份出现了报道,Coomb’s仅两省报道,近十年检查样本量不足150份。4.胶体金操作简便,可现场使用。检测样本量不大,只有浙江省报道。5. IgG ELISA的灵敏度、特异度均高,IgM ELISA灵敏度一般,但是可以分别检测IgG及IgM,对布病病程判断有一定参考价值。检测样本量不大,集中在内蒙古、山东、北京。6.相比实验室常用的离心柱核酸提取法,磁珠法操作简单,重复性好,耗时短,所得核酸完整度高,可用于样本量大且后接大片段核酸实验研究。7.水煮法的产物浓度和纯度都较高,耗时及费用低,重复性好,但核酸断裂严重,适用于样本量大,低成本,后接小片段PCR扩增时的核酸提取。8.菌液浓度的对数值与荧光定量PCR的Ct值满足关系式y=-3.0574x+46.171,可用于估计患者标本中的布氏菌含量。9.荧光定量PCR可检测布氏菌下限浓度为103CFU/ml,普通PCR检测布氏菌下限浓度为106CFU/ml。10.普通PCR检测IS313/IS639的检测下限为105 CFU/ml,B4/B5检测下限为106 CFU/ml, Brucl/Bruc5检测下限为107 CFU/ml。