本研究以II型登革病毒NS1蛋白为研究靶抗原，对II型登革病毒标准株NS1基因的克隆、蛋白表达纯化和复性以及其抗原性的鉴定，用该蛋白与灭活II型登革病毒交替免疫Balb／c小鼠，制备了一批针对II型登革病毒NS1蛋白的血清型特异性单克隆抗体，并建立了基于II型登革病毒NS1血清型特异性单克隆抗体的双抗体夹心ELISA法诊断检测方法，该方法既能对登革病毒感染者作出快速准确的早期诊断，又能对感染者作出分型诊断，此外其操作简便，成本低廉，并能实现登革热大规模爆发流行时的高通量筛查工作，为登革病毒感染的早期诊断和分型诊断提供了方法依据。 本研究主要分三个部分： 第一部分：II型登革病毒非结构蛋白NS1的克隆表达及抗原性鉴定 提取II型登革病毒总RNA，RT-PCR法扩增非结构蛋白NS1的全长基因，经TA克隆后，定向连接到原核表达载体pQE30中，经过筛选鉴定，获得稳定表达DV2-NS1蛋白的菌株。通过对表达条件及纯化条件的优化，经Ni-NTA亲和层析纯化，并经倍比稀释复性，最终获得可溶性的DV2-NS1蛋白，获得的蛋白经ELISA和WesternBlot鉴定，该蛋白与抗四型登革病毒NS1蛋白交叉单抗(7E9A2)特异结合，说明获得的DV2-NS1蛋白具有良好的抗原性，为下一步制备DV2-NS1蛋白特异性单克隆抗体奠定了物质基础。 第二部分：II型登革病毒非结构蛋白NS1血清型特异性单克隆抗体的制备与鉴定 利用获得具有良好抗原性的DV2-NS1蛋白，制备II型登革病毒非结构蛋白NS1血清型特异性的单克隆抗体，并对抗体进行免疫学特性研究和血清型特异性鉴定。采用重组DV2-NS1蛋白与灭活的II型登革病毒混合免疫Balb／c小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，分别用重组DV2-NS1蛋白和DV2病毒作为抗原，间接ELISA法进行筛选，结合免疫荧光(IFA)鉴定，经过多次融合筛选，最终获得了37株稳定分泌抗DV2-NS1蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株，经间接ELISA和IFA进一步鉴定，其中有23株与登革病毒其他3个血清型存在不同程度的交叉反应，另有14株DV2-NS1单克隆抗体为II型登革病毒NS1血清型特异性抗体，该14株抗体与登革病毒其他3个血清型均无交叉结合反应，仅特异结合DV2-NS1重组蛋白和II型登革病毒，经WesternBlot证实，该14株抗体结合位置在41KD处，与预测的NS1蛋白分子量一致。亚类测定14株血清型特异性单克隆抗体，其中两株为IgG2b，余均为IgG1。这些血清型特异性抗体的获得为下一步建立II型登革病毒非结构蛋白NS1双抗体夹心ELISA法的诊断检测方法奠定了基础。 第三部分：II型登革病毒非结构蛋白NS1双抗体夹心ELISA的建立 在获得了14株血清型特异性抗DV2-NS1蛋白单克隆抗体细胞株的基础上，制备腹水，纯化抗体，用生物素标记抗体，并检测每株抗体效价，分析单抗识别抗原位点，进行组合配对并筛选出最佳的抗体配对组合。14株血清型特异性DV2-NS1抗体经生物素(Biotin)标记后，采用相互竞争抑制实验分析单抗识别抗原位点，结果显示14株特异性单抗识别4个不完全相同的抗原位点。并利用单抗识别位点不同，进行单抗间的两两配对，将每一株抗体作为捕获抗体分别与其他不同抗原位点生物素标记单抗作为检测抗体进行相互配对实验，用II型登革病毒培养上清及重组DV2-NS1蛋白作为捕获抗原，进行最佳组合筛选，同时结合I型登革病毒及稀释液的本底值，经反复多次筛选，最终确定了以单克隆抗体4D41A6为捕获抗体，生物素标记的单克隆抗体5A47A8为检测抗体的最佳组合方案，用于构建II型登革病毒非结构蛋白NS1双抗体夹心ELISA诊断检测方法。建立的双抗体夹心抗原捕获法检测重组的DV2-NS1蛋白，其灵敏度为3.9ng／ml，其线性检测范围为10～100ng／ml。进一步检测不同血清型的登革病毒毒株和其他黄病毒的病毒液，结果显示，利用II型登革病毒非结构蛋白NS1血清型特异性抗体建立的诊断方法，只特异结合II型登革病毒，而与其他病毒无交叉反应，具有血清型特异性。建立的基于II型登革病毒非结构蛋白NS1双抗体夹心ELISA诊断检测方法具有高度敏感性和血清型特异性，为登革病毒感染的分型诊断和鉴别诊断提供了一种新的实验室诊断学方法。 综上所述，本研究得到如下的结论： 一、成功获得具有良好抗原性的可溶性DV2-NS1蛋白，并制备了一批抗登革病毒非结构蛋白NS1的单克隆抗体，其中23株为混合交叉型，与4个血清型登革病毒存在不同程度结合，另有14株为II型登革病毒NS1蛋白血清型特异性单克隆抗体，为建立II型登革病毒免疫学诊断方法、NS1蛋白功能研究及登革热疫苗研制提供了保障。 二、建立了II型登革病毒双抗体夹心NS1蛋白抗原捕获ELISA诊断方法，可特异地识别II型登革病毒血清型特异性NS1抗原，与其他相关病毒均无交叉，具有血清型特异性，可用于登革热分型诊断和鉴别诊断。