论文部分内容阅读
研究目的:纳米科技与生物医疗相结合已不再是全新话题,其中金纳米材料具备优良的理化性质、易被其他物质进行表面修饰等特性受到医学领域的热议。但是,纳米粒子的细胞毒性为其在医学中的应用带来困扰,明确其生物安全性将为金纳米粒子(Gold Naonoparticles,GNPs)在医学领域的长足发展提供基础。同时金纳米材料在骨组织再生中的作用一直受到关注,分析其在破骨细胞分化中的作用,将为其牙种植体涂层与骨结合方面的研究提供助益。本实验拟对金纳米粒子进行表征测定,并将不同浓度、不同粒径的金纳米粒子作为变量,对小鼠骨髓间充质干细胞进行体外培养,分析GNPs的理化性质、生物学相容性及对破骨细胞分化的抑制作用;并从活化T细胞核因子(nuclear factor-activated T cell 1,Nfatc 1)、c-fos 及抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate Resistent Acid Phosphatase,TRAP)基因入手,研究这些基因在GNPs体外诱导破骨细胞分化中的表达变化。研究方法:对金纳米粒子溶液进行扫描电镜及透射电镜检测,确定粒径大小;并明确金纳米粒子的Zeta电位,从而对其物理性质进行分析;取小鼠骨髓细胞,培养于含有巨噬细胞集落刺激因子(Macrophage Colony Stimulating Factor,M-CSF)的培养基中,孵育并筛分高纯度骨髓间充质干细胞;进行CCK8细胞毒性活力检测不同粒径及浓度的GNPs的生物相容性。通过加入核因子κ B受体活化因子配体(Receptor Activator of Nuclear Factor-κ B Ligand,RNAKL)对骨髓间充质干细胞进行诱导,作为阳性对照组,以不同粒径及三种等差浓度金纳米粒子作为实验组。在不同时间点对细胞进行分化状态的观察,及TRAP染色计数,从而比较不同浓度,不同粒径金纳米粒子诱导破骨细胞数量及分化程度。选出具有优良生物相容性及抑制破骨细胞分化作用的金纳米粒子,确认其浓度及粒径尺寸,进行RT-PCR检测Nfatc 1、c-fos、TRAP基因水平的差异。研究结果:电镜结果示金纳米粒子呈现卵圆形,分散均匀,未见明显团聚;Zeta电位为-5.68 mV;同时显微镜下见取得骨髓间充质干细胞形态及大小较为一致,分布均匀广泛,细胞形态多为多边形,长梭形,卵圆形不等,细胞体积均一。CCK-8细胞毒性活力结果示:在同一粒径条件下,50 ng/ml组金纳米粒子的细胞毒性明显,而30 ng/ml组及10 ng/ml组与空白对照组相比,未见差异。TRAP染色结果显示:在相同的诱导时间,相同浓度条件下,实验组细胞较阳性对照组细胞体积更小,TRAP阳性多核细胞数目更少,细胞形态多样;且20 nm实验组细胞呈多边形,TRAP 阳性多核细胞数目较40 nm实验组更少,有统计学差异;当诱导时间,GNPs粒径相同时,见10 ng/ml实验组较30ng/ml、50ng/ml组TRAP 阳性多核细胞占比最少,体积较小,细胞呈多角形。选择110ng/ml、20 nm直径的球形金纳米粒子行RT-PCR检测结果显示:Nfatc 1、c-fos以及TRAP趋势相似,基因表达量:阳性对照组>实验组>空白对照组,差异具有统计学意义(p<0.05)。实验结论:本实验所使用的球形金纳米粒子粒径均一,分散均匀,带有负电荷,呈现了优良理化性质。所取的小鼠骨髓细胞为高纯化的骨髓间充质干细胞。特定粒径的金纳米粒子可被细胞充分内吞于胞质内,且具有较好的生物相容性。GNPs具有抑制破骨细胞分化能力,呈现浓度依赖性、尺寸相关性。其抑制作用可能是通过抑制破骨相关基因Nfatc 1、c-fos、TRAP实现的。