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目的：建立大鼠骨髓间质干细胞体内突变致瘤单克隆肿瘤细胞株(K3)的裸鼠转移模型;经多次裸鼠体内传代转移后获得具有高转移潜能的细胞株;探讨高转移潜能细胞株的肿瘤干性特征变化及可能机制。
方法：大鼠问质干细胞体内突变肿瘤细胞株(K3)以1×106细胞/只接种于BALB/c-nu裸鼠皮下、脾脏内或胫骨端骨髓腔内,观察肿瘤转移发生情况。出现肝转移和肺转移瘤后,再重复致瘤一次后将肝和肺转移肿瘤细胞体外原代培养扩增,并经有限稀释后,获得了单克隆化的K3来源的肝转移细胞株(K3-F4)和肺转移细胞株(K3-B6)。通过transwell实验分析K3-F4,K3-B6细胞体外迁移和侵袭能力,荧光定量RT-PCR及Westernblot分析这两种细胞转移相关基因的表达情况,并通过磷酸钙转染法将K3,K3-F4,K3-B6细胞标记红色荧光蛋白后经尾静脉注射入裸鼠体内,活体成像观察裸鼠体内的转移潜能。通过软琼脂克隆形成实验分析K3-F4,K3-B6细胞体外成球能力,Westernblot检测他们的干性基因表达水平,皮下致瘤实验观察体内致瘤能力。通过免疫荧光、Westernblot、荧光定量RT-PCR实验分析K3-F4,K3-B6细胞EMT相关指标的表达情况。
结果：K3细胞株接种于BALB/c-nu裸鼠体内30d左右,皮下注射组裸鼠各器官未发现转移灶,脾脏内注射组裸鼠发生了肝脏转移,骨髓腔注射组裸鼠发生了肺转移。通过单个细胞培养获得单克隆的肝转移细胞株(K3-F4)和肺转移细胞株(K3-B6)。Transwell迁移和侵袭实验及小动物活体成像观察到,K3-F4,K3-B6细胞与K3细胞株的体内外转移潜能有很大差异(P＜0.05),K3-F4,K3-B6细胞中转移相关基因MMP2,CXCR4的表达高于K3细胞。软琼脂克隆形成实验及裸鼠皮下致瘤实验结果显示,K3-F4,K3-B6细胞的体内外致瘤能力较K3细胞强,并且肿瘤干性相关基因ABCG2,CD133,CD166,Bmi-1的蛋白表达也高于K3细胞。免疫荧光分析显示K3-F4,K3-B6细胞内Vimentin的表达高于K3细胞。Westenbolt结果显示K3-F4,K3-B6细胞中Vimentin和N-cadherin蛋白高表达。EMT促进分子snail,slug,ZEB1,在K3-F4,K3-B6细胞中的mRNA水平也明显高于K3细胞,而EMT负调控分子miR-200a表达下调。
结论：通过脾脏注射和骨髓腔注射的方法成功建立了大鼠间质干细胞体内突变肿瘤细胞株(K3)的肝脏和肺部转移模型。经肝肺转移后K3细胞的转移潜能和肿瘤干细胞特性增强,且肺转移细胞株(K3-F4)较肝脏转移细胞株(K3-B6)更加显著。肝肺转移细胞株的肿瘤干性特性及转移潜能的增强可能与其受到EMT相关分子调控从而发生间质化改变有关。