1目的在中医“脾虚致痹”、“脾虚致瘀”理论指导下,以“血瘀证”为切入点,研究、探讨血小板微粒(PMPs)在类风湿关节炎(RA)发病中的具体作用及中医机制。通过复制RA动物模型,观察佐剂关节炎(AA)大鼠足跖肿胀度、关节炎指数(AI)、滑膜细胞超微结构、血小板超微结构、PMPs、血小板参数、炎症因子、生长因子、血小板细胞PI3K/AKT、JAK/STAT通路相关指标表达变化情况,评价“健脾化湿通络”中药新风胶囊(XFC)对其影响,探讨、阐释XFC抑制PMPs释放的作用机制。2方法2.1理论研究搜集、筛选、归纳诱导RA血小板微粒异常表达机制的国内外最新资料,从理论角度探讨、分析细胞因子、PI3K/AKT、JAK/STAT信号通路调控血小板细胞释放PMPs机理及其之间关系。从中医基础理论阐述中医“脾虚”与“血瘀”之关系,基于“脾”与“痹”之联系探讨痹证发病病机,阐释健脾化湿通络法治疗RA血瘀证的机制。2.2实验研究将雄性SD大鼠随机分为正常对照(NC)组,模型对照(MC)组,LY294002组,AG490组、XFC组,雷公藤多苷片(TPT)组,将弗氏完全佐剂(CFA)0.1 ml注射至除NC组外各组大鼠右后足趾皮下,于造模后第15 d向前期注射CFA大鼠尾根部再次注射0.05 ml CFA以加强免疫,复制AA大鼠模型。于造模后第19 d给药,给药量及给药方式如下:正常对照组及模型对照组:予生理盐水灌胃,1ml/100g/d;LY 294002组:予生理盐水灌胃,1ml/100g/d,大鼠腹腔注射LY29400(5 mg/kg),2次/w。AG490组:予生理盐水灌胃,1ml/100g/d;大鼠腹腔注射AG490(20 mg/kg),2次/w。XFC组:XFC去壳研末充分溶于生理盐水,0.034g/1ml/100g/d灌胃。TPT组:TPT研末充分溶于生理盐水,0.57mg/1ml/100g/d灌胃。各组大鼠连续给药30天。观察各组大鼠体质量、足跖肿胀度、AI变化;流式细胞术检测的PMPs表达的变化;全血细胞分析仪检测的血小板参数表达的变化;电镜下观察血小板超微结构改变;酶联免疫吸附法检测血清细胞因子IL-6、IL-10、TNF-α表达的变化;免疫组化法检测滑膜IL-10、TNF-α、VEGF、ES、CD31表达的变化;RT-PCR、免疫印迹法检测血小板细胞PI3K/AKT、JAK/STAT通路基因、蛋白表达的变化。3结果3.1理论研究结果3.1.1 PI3K/AKT通路激活促进PMPs释放,介导免疫炎症及血管翳形成PI3K活化后,磷酸化AKT,活化的AKT调控其下游靶蛋白表达,提高PMPs表达释放,调节生长因子、炎症因子表达,介导RA滑膜免疫炎症及血管翳形成。3.1.2 JAK/STAT信号通路介导血小板病变IL-6可活化JAK2/STAT3通路,激活STAT转移至细胞核与相应DNA结构域集合,调控靶基因表达。SATA3可调节巨核细胞后期分化、发育,调控血小板细胞功能,介导血小板病变。3.1.3 mi R-21、PTEN连接PI3K/AKT、JAK/STAT通路,协同调控PMPs释放JAK/STAT激活后,可上调mi R-21表达。PTEN是mi R-21下游调控靶基因之一,mi R-21与PTEN之间存在显著负相关趋势。mi R-21高表达可抑制PTEN表达,PTEN是PI3K/AKT信号通路的主要负性调节蛋白,下调PTEN可激活PI3K/AKT,促进PMPs释放。3.1.4血瘀证贯穿RA病程在痹病发病的初期,可因六淫外邪痹阻经脉,而致气血运行不畅;伴随病情发展,病程中多见正气与邪气交织而见气滞血瘀;随着病程迁延,久病入络,而致血瘀。由此可见血瘀证贯穿痹证病程始终。3.1.5“脾虚”是RA血瘀证的发病基础脾胃虚弱,脾失健运,运化水谷津液失权,气血津液生化不足,气虚血少,阴津不足可成瘀致痹;脾失健运,机体津液代谢障碍,遂生痰湿,痰浊痹阻脉道可成瘀致痹;脾气亏虚,统血无权,可致血逸脉外而变生瘀血致痹。3.1.6 RA血小板微粒升高是血瘀证的重要体现PMPs表达异常促进了与血瘀状态相关的机体免疫炎症反应、血栓形成、血管硬化、血管新生等生理、病理过程,是血瘀证发生的重要物质基础。3.1.7“健脾化湿通络法”可明显改善RA血瘀证RA患者血瘀证病机总体呈现“脾胃虚弱,生化乏源、统摄无力、痰湿内生”及“虚实夹杂”特点,临床采用“扶正祛邪”治则,应用“健脾化湿通络”的治法,使用XFC治疗RA血瘀证患者,可抑制血小板活化,调节血小板参数,改善RA患者血瘀状态。3.2实验研究结果3.2.1 XFC对各组AA大鼠PMPs、血小板参数、超微结构影响与NC组比较,MC组PMPs、血小板参数PLT、PCT升高(P<0.05或P<0.01)。电镜下MC组血小板超微结构可见血小板外形稍膨胀,欠规整,伪足伸出,胞质中α颗粒、线粒体减少,血小板结构破坏明显,部分血小板表面可见血小板微粒形成。与MC组比较,XFC组PMPs、血小板参数PLT、PCT均显著下降(P<0.05或P<0.01);电镜下XFC组血小板呈椭圆形状规整,稍有少许伪足伸出,胞质结构无明显损伤、胞质中α颗粒、线粒体较MC明显增多。与TPT组比较,XFC组PMPs、PLT降低;与XFC组比较,LY294002组PLT升高,AG490组PMPs、PLT升高(P<0.05或P<0.01)。TPT组血小板伪足较XFC组增多,胞质中α颗粒、线粒体较XFC组较少。LY294002、AG490组血小板细胞外形欠规整,少有伪足伸出,可见α颗粒、线粒体分布。3.2.2 XFC对各组AA大鼠足趾肿胀度、AI、体质量变化影响相关性研究表明:AA大鼠外周血PMPs与足跖肿胀度、AI呈正相关,与体质量呈负相关(P<0.01或P<0.05);与NC组比较,MC组足跖肿胀度、AI表达显著升高,体质量降低;与MC组比较,XFC组足跖肿胀度、AI表达显著降低,体质量升高(P<0.05或P<0.01)。与XFC组比较,LY294002组及AG490组大鼠足趾肿胀度显著升高,TPT组无明显差异;与XFC组比较,LY294002组、TPT组AI升高,AG490组无明显差异;与XFC组比较,其余各组治疗后大鼠体质量显著降低(P<0.05或P<0.01)。3.2.3 AA大鼠关节形态学变化及XFC对其影响NC组足趾关节滑膜组织光镜下可见无明显炎细胞浸润,未见明显滑膜组织增生及血管翳形成,关节面光滑,完整。电镜下NC组滑膜细胞内线粒体较多,形状规整,内质网丰富,染色体均匀分布。光镜下MC组见大量炎细胞浸润、有典型血管翳形成侵蚀关节面,关节软骨受到破坏。电镜下MC组胞质内线粒体数量变少,内质网断裂、染色体聚集。光镜下XFC组滑膜组织炎细胞较少,关节软骨完整性未见明显破坏。电镜下XFC组滑膜细胞胞质内线粒体、内质网较丰富,染色体均一,嵴突完整,排列规整。光镜下TPT组滑膜组织炎细胞浸润明显,有少量非典型血管翳形成,关节面大体完整;LY294002组及AG490组大鼠关节滑膜可见炎细胞浸润,少量血管增生,滑膜组织嵌入关节腔内。电镜下TPT组胞质内可见线粒体形状稍变形,部分可见染色体聚集,嵴突结构排列欠规整。LY294002组线粒体有变形,数量稍降低,内质网欠丰富,嵴突变短。AG490组胞质内线粒体数量降低,内质网稍减少,染色体散在分布于胞质内,嵴突欠规整。3.2.4 AA大鼠血清细胞因子变化及XFC对其影响相关性研究表明:AA大鼠外周血PMPs表达与血清细胞因子IL-6、TNF-α、Th1/Th2呈显著正相关,与IL-10呈显著负相关(P<0.05或P<0.01);与NC组比较,MC组大鼠血清IL-6、TNF-α表达升高,IL-10表达降低,Th1/Th2升高(P<0.05或P<0.01)。与MC组比较,XFC组大鼠血清IL-6、TNF-α表达降低,IL-10表达升高,Th1/Th2显著降低;(P<0.05或P<0.01)。与TPT组比较,XFC组大鼠血清IL-6表达降低、IL-10表达量升高,Th1/Th2降低;与XFC组比较,LY294002组大鼠血清TNF-α、IL-6表达升高,IL-10表达降低,AG490组大鼠血清IL-6表达升高,IL-10表达降低(P<0.05或P<0.01)。3.2.5 AA大鼠滑膜炎症因子变化及XFC对其影响相关性分析表明,AA大鼠外周血PMPs表达与滑膜组织细胞因子TNF-α、Th1/Th2呈显著正相关,与IL-10呈显著负相关(P<0.05或P<0.01);与NC组比较,MC组大鼠滑膜组织TNF-α表达升高、Th1/Th2升高,IL-10表达降低(P<0.05或P<0.01);与MC组比较,XFC组滑膜组织TNF-α表达减低、Th1/Th2减低,IL-10表达升高(P<0.05或P<0.01);与TPT组比较,XFC组大鼠血清IL-10表达升高,Th1/Th2降低;与XFC组比较,LY294002组IL-10表达降低,Th1/Th2升高;AG490组IL-10表达降低,Th1/Th2升高(P<0.05或P<0.01)。3.2.6 AA大鼠滑膜组织生长因子及MVD变化及XFC对其影响相关性分析表明:PMPs与滑膜组织细胞因子VEGF、MVD呈正相关,与ES呈负相关(P<0.05或P<0.01)。与NC组比较,MC组大鼠滑膜组织VEGF、MVD表达显著升高,ES表达降低(P<0.05或P<0.01)。与MC组比较,XFC组滑膜组织VEGF、MVD表达显著降低,ES表达升高(P<0.05或P<0.01);与TPT组比较,XFC组ES表达升高;与XFC组比较,LY294002组VEGF升高,ES降低,AG490组ES表达降低(P<0.05或P<0.01)。3.2.7 AA大鼠血小板细胞JAK2/STAT3通路表达及XFC对其影响相关性分析表明:AA大鼠外周血PMPs与mi R-21 m RNA呈显著正相关;PMPs与P-JAK2、STAT3、P-STAT3蛋白呈显著正相关(P<0.05或P<0.01);与NC组比较,MC组大鼠血小板细胞mi R-21 m RNA、JAK2、P-JAK2、STAT3、P-STAT3蛋白表达升高(P<0.05或P<0.01)。与MC组比较,XFC组mi R-21 m RNA、JAK2、P-JAK2、STAT3、P-STAT3表达降低(P<0.05或P<0.01)。与TPT组比较,XFC组mi R-21 m RNA、JAK2、P-JAK2、P-STAT3蛋白表达降低(P<0.05或P<0.01)。与XFC组比较,LY294002组mi R-21 m RNA、JAK2、P-JAK2表达升高,AG490组STAT3蛋白表达升高(P<0.05或P<0.01)。3.2.8 AA大鼠血小板细胞PI3K/AKT通路表达及XFC对其影响相关性分析表明:AA大鼠PMPs与PI3K表达呈显著正相关;PMPs与PTEN表达呈负相关,与P-AKT表达呈正相关;与NC组比较,MC组血小板细胞PTEN蛋白表达降低,PI3K、AKT、P-AKT蛋白表达升高。与MC组比较,XFC组PTEN蛋白表达升高,PI3K、AKT、P-AKT蛋白降低。与TPT组比较,XFC组PI3K、P-AKT蛋白表达降低;与XFC组比较,LY294002组PTEN蛋白表达显著降低,PI3K蛋白表达显著升高;AG490组PI3K、AKT蛋白表达升高(P<0.05或P<0.01)。3.2.9 AA大鼠血小板细胞PI3K/AKT通路表达及XFC对其影响相关性分析表明,AA大鼠PMPs与BCL-2蛋白表达呈显著正相关,与BAD蛋白表达呈显著负相关(P<0.05或P<0.01);与NC组比较,MC组大鼠血小板细胞BCL-2蛋白表达显著升高,BAD蛋白表达显著降低(P<0.05或P<0.01)。与MC组比较,XFC组大鼠血小板细胞BCL-2蛋白表达降低,BAD蛋白表达升高(P<0.05或P<0.01)。与TPT组比较,XFC组大鼠血小板细胞BAD蛋白表达升高;与XFC组比较,LY294002组大鼠血小板细胞BCL-2蛋白表达升高;AG490组大鼠血小板细胞BAD蛋白表达降低(P<0.05)。4结论4.1 AA大鼠PMPs的变化4.1.1 AA大鼠PMPs变化特点AA大鼠PMPs释放增多,并与促炎因子、促血管生长因子表达呈正相关,与抑炎因子、抑制血管生长因子表达呈负相关,表明AA大鼠PMPs介导了AA大鼠炎症反应及血管新生。4.1.2 PI3K/AKT及JAK2/STAT3信号通路协同作用介导了PMPs释放JAK2/STAT3通路在炎症细胞因子IL-6作用下激活,上调下游靶基因,诱导mi R-21升高,进而抑制PTEN表达,PTEN负性调控PI3K/AKT活化,引起下游蛋白BCL-2升高,BAD降低,导致PMPs释放增多。4.1.3 RA血小板微粒高表达中医病机呈“脾虚血瘀”特征RA患者血瘀证中医学病机总体呈现“脾胃虚弱,生化乏源、统摄无力、痰湿内生”及“虚实夹杂”特征,RA血小板微粒表达升高是血瘀证的重要体现。4.2“健脾化湿通络”中药XFC对AA大鼠的疗效4.2.1 XFC能增加AA大鼠的体质量XFC组方含黄芪、薏苡仁具有益气健脾作用,能改善胃肠道功能,增加大鼠摄食及饮水量,升高体质量。4.2.2 XFC能降低AA大鼠足跖肿胀度、AI、抑制滑膜病理改变XFC具有明显的抑制免疫炎症反应作用,可抑制弗氏完全佐剂诱导的足趾关节免疫炎症反应,降低足趾及全身关节炎症反应,从而起到改善关节症状的作用。4.3 XFC抑制血小板微粒释放的作用机制4.3.1改善滑膜病变,抑制PMPs表达XFC能下调滑膜组织TNF-α、VEGF,上调IL-10、ES表达,调节滑膜组织Th1/Th2平衡,降低微血管密度,抑制血管增生,抑制滑膜组织炎症反应,降低AA大鼠足趾肿胀度,改善关节功能。4.3.2调节外周血细胞因子平衡,抑制PMPs表达XFC可通过提高外周血抑炎性因子表达,调节Th1/Th2平衡,下调促炎因子表达,抑制全身炎症反应,降低关节炎指数,改善血小板参数,提高体质量,改善整体症状。4.3.3改善血小板参数、超微结构,抑制PMPs表达XFC可通过改善血小板参数,降低血小板细胞超微结构破坏,抑制血小板细胞释放PMPs。4.3.4抑制IL-6/JAK2/STAT3信号通路,抑制PMPs表达XFC可调节AA大鼠外周血Th1/Th2平衡,上调IL-10,降低IL-6表达,下调JAK2、STAT3表达,进而下调PMPs释放。4.3.5调控mi R-21、PTEN表达,抑制PMPs表达XFC可通过抑制JAK2/STAT3信号通路下调mi R-21 m RNA表达,上调PTEN蛋白表达,产生抑制PMPs表达效应。4.3.6调节PI3K/AKT信号通路,抑制PMPs表达XFC可通过上调血小板细胞PTEN表达,抑制PI3K/AKT信号通路激活,降低PMPs表达。4.3.7上调BAD表达,下调BCL-2表达,抑制PMPs表达XFC可通过可上调促调亡指标BAD表达,下调抗调亡指标BCL-2表达,抑制PMPs表达。