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猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）是猪地方性肺炎（猪气喘病）的病原体。此病分布广，发病率高，致死率低。由于Mhp能够破坏呼吸道粘膜-纤毛屏障，从而容易继发其他病原的感染，导致致死率升高。由于早期诊断的困难和缺乏有效的药物（包括疫苗），在该病控制方面至今未能达到令人满意的效果。本实验以Mhp中国株ZCF23为材料，研制出其特异性单克隆抗体，为摸索Mhp诊断新方法奠定了基础。 1、用全菌蛋白免疫制备猪肺炎支原体单克隆抗体 用KM2培养基（含马血清）培养Mhp ZCF23株。高速离心收获培养物，用PBS悬浮沉淀。悬液经反复冻融裂解后作为免疫原，与等量弗氏完全佐剂（首次）、不完全佐剂（后三次）混合后腹腔注射免疫8周龄BALB／c小鼠（400μg／只），间隔为两周。尾静脉追加免疫相同剂量抗原（不加佐剂）5天后，取免疫鼠脾细胞和骨髓瘤Sp2／0细胞进行融合。用间接ELISA方法反复筛选阳性克隆，并经有限稀释法3次克隆化后，得到了5株分泌特异性抗体的单克隆细胞株，分别命名为：11C6、14C11、11B6-1、10C11-2和12E7-1。生物学特性鉴定表明，五株腹水单抗的间接ELISA效价均在1∶104左右；免疫球蛋白亚类均为IgG3。免疫印迹结果表明，五株单抗所针对的抗原表位在90kD、40kD、70kD和60kD左右，而且不与马血清蛋白反应，说明以上单抗均是针对Mhp蛋白的特异性单抗。 2、猪肺炎支原体种特异性蛋白P36基因的克隆与表达 已有报道，P36蛋白是Mhp种特异性蛋白，在自然感染过程中，能够产生较强的抗体反应。而且，P36基因在Mhp进化过程中是高度保守的。本试验根据Genbank中P36基因序列设计了一对特异性引物，通过PCR扩增ZCF23株P36基因序列，凝胶电泳结果显示，扩增出948bp左右的条带，与预期结果相符。将PCR产物克隆入pGEM T Easy载体中并进行测序。测序结果与Genbank中P36基因序列比较发现，同源性达99.9％，只有一处碱基发生变异（由A变为G）。所编码扬州大学硕士学位论文的氨基酸序列同源性达100%。从而进一步验证了P36基因序列的保守性。对其所编码的氨基酸序列抗原性表位预测发现，在3巧个氨基酸序列中有巧个可能的抗原表位。序列确认后，用Ec口Rl和肠口I将P36基因从克隆载体中切出，并插入到GsT融和表达载体pGEx 6p一1相应位点，构建成重组表达载体pGEX 6p一1一P36，并转化宿主菌BLZI。阳性克隆命名为BLZI（6P一l一P36）。重组菌经过IPTG诱导，并通过SDS一以GE电泳鉴定，结果表明，P36基因获得了表达。将其超声波裂解后，高速离心分离上清和沉淀，分别进行SDS一PAGE电泳，结果表明，表达产物GST一P36以可溶性蛋白和包涵体两种形式存在。3.抗猪肺炎支原体P36蛋白单克隆抗体的制备 重组菌BLZI（6P一1一P36）经诱导表达，超声波裂解后高速离心，分别收集上清和沉淀。可溶性表达产物亲和层析纯化后用于检测;同时，用GST一P36包涵体沉淀与等量弗氏完全佐剂（首次）、不完全佐剂（后三次）混合后，分4次腹腔注射免疫8周龄BALB/c小鼠（400 pg/只），间隔为两周。在尾静脉追加免疫纯化P36蛋白（100协g/只）3天后，取免疫鼠脾细胞和骨髓瘤SpZ/0细胞进行融合。用间接ELIsA方法反复筛选阳性克隆，并经有限稀释法2次克隆化后，获得了一株能分泌特异性抗体的单克隆细胞株，命名为5A7一2。生物学特性鉴定表明，腹水单抗的间接 ELIsA效价为1:2.5 xl护;免疫球蛋白亚类为IgGZa。免疫印迹结果显示，腹水单抗与GST一P36融合蛋白反应而不与GST蛋白反应，并且在Mhp蛋白36kD位置也有明显的条带，说明细胞株5A7一2所分泌的是针对Mhp P36蛋白的单抗。P36蛋白携带Mhp种特异性抗原表位，并且P36蛋白多抗也不与其它支原体或细菌反应，因此，其单克隆抗体的制备，为MhP种特异性检测方法的建立奠定了基础。