论文部分内容阅读
目的:骨强度降低是骨质疏松(osteoporosis,OP)发病机制中的重要环节,而Ⅰ型胶原(typeⅠ collagen)是骨组织有机基质中的主要组分,Ⅰ型胶原的代谢异常严重影响骨强度。OP患者骨组织中积聚人量糖基化终产物(advanced glycation end poducts,AGEs),是骨质疏松的致病因素之一。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)是参与胞外基质降解的主要物质,其分泌和表达受基质金属蛋白酶诱导产物(extracellular matrix metalloproteinaseinducer,EMMPRIN)的调节。因此,本试验旨在观察AGEs在小鼠成骨细胞株(mouseembryo/fetus calvaria fibroblasts,MC3T3E1)与破骨前体细胞株(mononuclear cells,RAW264.7)共培养体系中对Ⅰ型胶原的合成、降解及在降解过程中发挥重要作用的MMPs分泌的影响,从而探讨AGEs是否通过影响Ⅰ型胶原的合成与降解而改变骨强度,为防治AGEs引起的骨强度降低提供试验基础和理论依据。
方法:建立成骨细胞与破骨细胞共培养体系。运用体外制备的不同浓度的AGE-BSA(50mg/L、100mg/L、200mg/L、400mg/L)、EMMPRlN中和抗体(5mg/L)干预共培养体系24h。半定量RT-PCR检测Ⅰ型胶原mRNA水平和单核细胞株破骨细胞表型、功能基因的表达;Westernblot检测细胞中Ⅰ型胶原蛋白水平;ELISA检测细胞上清中Ⅰ型胶原水平;测定细胞上清中MMP-2、MMP-9的水平,观察AGEs对Ⅰ型胶原降解的影响。
结果:1.单核细胞株RAW264.7能表达成熟破骨细胞的表型标志基因如核因子κB受体活化子、抗酒石酸酸性磷酸酶及骨吸收有关的功能基因如组织蛋白酶K、整合素αv;2.AGE-BSA促进成骨细胞Ⅰ型胶原mRNA、蛋白水平表达;也使共培养体系中成骨细胞Ⅰ型胶原mRNA、蛋白水平显著增加(P＜0.05),并随AGE-BSA浓度的增加而递增(P＜0.05);共培养后成骨细胞Ⅰ型胶原mRNA、蛋白水平较单独培养的成骨细胞组增高(P＜0.05)。3.AGE-BSA干预成骨细胞后,上清中Ⅰ型胶原含量随AGE-BSA干预浓度的增加而减少(P＜0.05);共培养体系上清中Ⅰ型胶原的含量也呈剂量依赖方式减少(P＜0.05);共培养组上清中Ⅰ型胶原水平较单独培养的成骨细胞上清明显减少(P＜0.05)。4.AGE-BSA呈剂量依赖方式分别促进成骨细胞及破骨前体细胞MMP-2、MMP-9的分泌(P＜0.05);AGE-BSA促进共培养体系中细胞MMP-2、MMP-9的分泌,同样呈剂量依赖方式增加(P＜0.05);MC3T3E1细胞及RAW264.7细胞上清中MMP-2及MMP-9的水平较共培养体系上清中显著减少(P＜0.05)。5.加入EMMPRIN中和抗体后上清中MMP-2、MMP-9水平减少,Ⅰ型胶原的含量显著增加(P＜0.05)。
结论:1.单核细胞株RAW264.7具有破骨细胞特征性基因表达谱,是一种较好的破骨前体细胞模型。2.AGEs可增加共培养体系中成骨细胞Ⅰ型胶原基因与蛋白水平的表达,提示AGEs可促进Ⅰ型胶原的合成。3.AGEs促进MMP-2及MMP-9的分泌,并使上清中Ⅰ型胶原的含量减少,加入EMMPRIN中和抗体抑制MMPs分泌后Ⅰ型胶原的含量明显增加,提示AGEs通过MMPs促进Ⅰ型胶原的降解。4.AGEs增加成骨细胞Ⅰ型胶原的合成,同时促进Ⅰ型胶原的降解,提示AGEs可能通过打破Ⅰ型胶原合成与降解之间的平衡,使降解多于合成,进而降低骨强度。