论文部分内容阅读
目的：观察低氧微环境对结肠癌细胞增殖、侵袭及自噬的影响,探讨低氧微环境对结肠癌细胞生存的影响及与细胞自噬的关系。方法：(1)运用厌氧罐构建低氧微环境,免疫荧光法观察HIF-2α的表达,验证低氧微环境是否构建成功。(2)利用免疫磁珠分选法从结肠癌SW480细胞系中分选出CD133+细胞,分选后的结肠癌CD133+细胞在无血清培养基中悬浮培养。观察结肠癌CD133+细胞从分选后的单细胞悬浮状态到形成克隆球细胞形态的变化,与分选前的SW480细胞形态进行对比。(3)运用台盼蓝细胞活性率实验、Boyden小室实验研究低氧的微环境对结肠癌细胞生存状态的影响。(4)透射电子显微镜(TEM)技术观察细胞发生自噬时的超微结构,MDC荧光染色观察自噬囊泡的形成,MDC荧光染色联合流式细胞术量化自噬发生的强度,Western blotting实验检测在低氧的微环境中细胞内LC3蛋白水平表达的变化。探讨低氧微环境对SW480细胞及CD133+细胞自噬发生的影响。(5)通过免疫组织化学技术对94例结直肠癌病人组织进行染色,分别观察HIF-2α及Beclin1与患者的性别、年龄、浸润深度、分化程度、淋巴结转移、Duke’s分期、以及生长部位的关系。结果：(1)当细胞处于低氧状态时,HIF-2a的表达明显增加,细胞膜周围出现绿色荧光,证实在本研究中构建低氧微环境成功。(2)免疫磁珠分选技术在SW480细胞系中分选出CD133+细胞,分选后在无血清的培养液中进行培养,逐渐形成克隆球。(3)Boyden小室实验中低氧微环境增加结肠癌细胞SW480进入下室的细胞数量。台盼蓝染色实验显示,与对照组相比,低氧微环境中SW480活细胞率随着时间的延长而降低(P<0.05)；但CD133+活细胞率无显著改变。(4)在实验组低氧的微环境中,运用透射电子显微镜(TEM)观察到发生自噬时的超微结构自噬囊泡的形成；免疫荧光结合流式细胞仪观察到SW480细胞的MDC荧光强度由20.53±0.64降低至17.00±0.20,而CD133+细胞的MDC荧光强度由19.89±0.58增加至33.13±1.95(P<0.05)。；Western blotting实验检测在低氧的微环境中细胞内LC3蛋白水平表达增加。(5)通过免疫组织化学技术对94例结直肠癌病人组织进行染色,结果提示HIF-2α的表达与结直肠癌患者的组织分化程度及淋巴结的转移相关,与患者的性别、年龄、浸润深度、Duke’s分期、以及生长部位不相关；而Beclin1的表达与结直肠癌患者的组织分化程度、淋巴结的转移及Duke’s分期相关,与患者性别、年龄、浸润深度及生长部位不相关。结论：(1)低氧微环境促进了SW480细胞的侵袭,并且在抑制自噬发生的同时降低SW480细胞活性。低氧微环境中自噬水平下降因此不能发挥对SW480细胞的保护作用。(2)低氧微环境对CD133+细胞的侵袭无明显影响,但在促进自噬发生的同时维持CD133+细胞活性保持不变。低氧微环境中自噬水平的增强对CD133+细胞发挥保护作用。(3)在相同的低氧微环境中两种细胞亚型的自噬发生现象不同,低氧微环境能够抑制SW480细胞发生自噬,促进CD133+细胞自噬的发生。(4)HIF-2a的表达与结肠癌组织的分级成负相关,与淋巴结的转移成负相关；Beclin1在结肠癌组织中的表达与组织分级成负相关,与淋巴结转移成正相关,与Duke’s分期成负相关；结肠癌组织中随着分化程度的降低恶性度的增高,组织发生缺氧程度越高,自噬现象越明显；低氧微环境及自噬可能在结肠癌发生中具有促进作用。