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骨骼肌维持运动功能并调节机体代谢,对其生长发育和再生研究对于提高家畜的产肉量、提升肉品质具有重要意义。肌细胞增强因子2A(MEF2A)是肌生成过程中重要的转录因子,参与骨骼肌、心肌发育及骨骼肌的再生。已有的研究表明MEF2A缺失严重抑制骨骼肌成肌细胞分化和骨骼肌再生,但关于MEF2A能否调控成肌细胞的增殖尚无明确报道,并且MEF2A调控成肌细胞分化的下游靶点和信号通路机制尚不完全明确。基于此,本学位论文课题以秦川牛为研究对象,系统研究了MEF2A对骨骼肌成肌细胞增殖和分化的调控作用及机理,旨在为秦川牛的肉用遗传改良和分子育种提供理论基础,同时为大动物中骨骼肌的生理和病理学研究提供支撑。主要研究结果如下:1.本研究利用二型胶原酶/中性蛋白酶联合消化法及选择培养基差速贴壁法成功从牛骨骼肌中分离得到高纯度、高分化潜能的成肌细胞。RT-PCR结果显示,MYOD1的表达量在成肌细胞诱导分化的第0天至第6天逐渐上调,之后表达量逐渐下降;MYF6、MYOG和MYH1的表达量则随成肌细胞的分化逐渐升高。说明本研究分离得到的骨骼肌成肌细胞完全满足于后续实验研究。2.在秦川牛从6月龄到24月龄生长发育过程中,MEF2A基因mRNA的表达量逐渐上升。在体外培养的成肌细胞诱导分化的过程中,MEF2A基因mRNA和蛋白的表达量也均逐渐提高。该研究结果提示MEF2A的功能与秦川牛骨骼肌的生成和成肌细胞的分化密切相关。3.在成肌细胞培养过程中,MEF2A过表达增加了增殖细胞比例,同时促使大量细胞由G1期进入S期。RT-PCR与Western blot结果显示,MEF2A过表达显著提高了PCNA、CCNA2、CCNE1、CCNE2等细胞增殖相关基因mRNA的表达水平和PCNA、CDK2蛋白表达水平。4.MEF2A表达水平的精准调控是维持成肌细胞分化所必需。MEF2A沉默抑制成肌细胞分化,并显著下调MYOZ2表达量。通过双荧光素酶报告载体活性检测,本研究发现MEF2A可以直接促进MYOZ2基因启动子的转录活性,而MYOZ2沉默后也显著抑制了成肌细胞的分化。相反,MEF2A过表达则引发严重的细胞凋亡。5.在成肌细胞分化过程中,MEF2A沉默后抑制MEG3基因的表达,同时抑制MEG3/DIO3位点miR-758和miR-543的表达,miR-758和miR-543的下调解除了其对PPP2R2C基因的转录抑制,使得PPP2R2C的表达量得以上调,进而激活了PP2A信号通路,抑制成肌细胞分化。综上,MEF2A是骨骼肌生成过程中的重要转录调控蛋白,MEF2A不仅能够促进成肌细胞的增殖,同时,MEF2A表达水平的精准调控是维持成肌细胞分化所必需,MEF2A敲低或过表达均抑制成肌细胞分化。此外,本研究利用体外培养细胞系统研究MEF2A调控成肌细胞分化机制,揭示MEF2A可直接通过MYOZ2和MEG3/DIO3-PP2A两条信号通路调控成肌细胞的分化。本课题为在大动物中研究骨骼肌的生长发育提供了借鉴,同时为通过调节成肌细胞的增殖和分化实现秦川牛的肉用遗传改良和分子育种提供了新的思路。