牙周炎作为常见的口腔慢性炎症性疾病,常导致牙周支持组织破坏,进而造成牙齿脱落,并可以影响一些全身性疾病的发病和病程。但是至今对于牙周炎发病及病程发展的机制尚不完全明确。牙周炎在发病过程中,炎性组织可以产生血管生成因子和炎性细胞因子,促进细胞内皮向分化,最终形成大量新生血管。现已证实牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)具有向内皮细胞分化并形成血管的能力,但是对于调控其分化的胞内机制尚不完全明确。细胞外调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)通路是调节细胞活动的关键通路之一,在真核细胞内广泛存在,影响着细胞分裂增殖、分化、自噬、凋亡等多种生理病理行为。ERK1/2是ERK通路的关键蛋白,ERK1/2的磷酸化和去磷酸化是将分子信号从细胞表面受体转导至核内的关键步骤。当细胞受到细胞外基质的生长因子刺激后,ERK1/2通过一系列酶反应被激活,从而对细胞的活动进行调节。牙周膜干细胞在不同局部微环境下的多向分化能力是否发生变化、如何变化、受到什么因素或信号的调节、对生物学功能有何影响等已经有一些研究报道,但主要集中于成骨分化方向;对其他方向分化可能及影响程度等尚少有研究。本课题针对于此,使用TNF-α模拟炎症微环境,观察ERK通路的活化对正常及炎症微环境下PDLSCs内皮向分化的调控作用;为进一步深入探讨不同分化方向能力变化和选择性调控奠定实验基础。1研究目的:探讨正常及炎症微环境下,erk通路在pdlscs内皮向分化中的作用,为pdlscs分化调控应用提供理论依据。1.1体外培养和鉴定人牙周膜干细胞(hpdlscs)。使用血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,vegf)和碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor,b-fgf)联合诱导pdlscs内皮向分化,检测诱导后细胞内皮向分化相关的相关指标水平,建立pdlscs内皮向分化模型。在体外使用炎性因子tnf-α模拟体内炎症微环境对pdlscs进行刺激,并检测内皮向分化相关指标,建立炎症微环境内皮向分化模型。1.2按所建立正常及炎症微环境内皮向分化模型,对pdlscs进行内皮向分化诱导,检测诱导后细胞增殖情况和内皮向分化相关指标水平。比较两种不同诱导环境对pdlscs增殖和内皮向分化的影响。1.3按照模型诱导pdlscs分化,观察细胞内erk1/2磷酸化水平随不同时间点和诱导方法而发生的改变。1.4阻断erk1/2磷酸化过程后,在正常及炎症微环境对pdlscs进行内皮向分化诱导,检测诱导后细胞增殖情况和分化相关指标水平。比较阻断前后细胞分化能力的改变,明确erk通路对pdlscs内皮向分化的作用。2研究方法:2.1采用酶消化法获取原代牙周膜细胞,单细胞克隆纯化细胞。克隆形成实验检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞表面表达间充质干细胞标志物的阳性率,成骨及成脂诱导定性检测细胞多向分化能力。2.2对两种诱导环境下的pdlscs进行内皮向分化诱导,real-timepcr检测pdlscs诱导后内皮相关基因cd31、vegf及ve-cadherinmrna的转录水平。流式细胞术检测诱导后细胞中cd31+和ve-cadherin+细胞比例。matrigeltm基质胶内进行细胞管腔形成实验,并拍照统计管腔形成数目、分支节点数及管腔长度。根据这些指标比较正常及炎症微环境pdlscs内皮向分化能力的差异。2.3使用u0126作为erk1/2磷酸化阻断剂,溶剂dmso作为阴性对照。提取pdlscs诱导后0h、1h、3h、6h、12h的蛋白,westernblotting检测erk1/2磷酸化水平。正常及炎症微环境内诱导以及加入u0126后分化诱导1h,提取蛋白检测erk1/2磷酸化水平。2.4加入u0126阻断erk1/2磷酸化过程,正常及炎症微环境内对pdlscs进行内皮向分化诱导,dmso作为阴性对照,real-timepcr检测诱导后pdlscs内皮相关基因cd31、vegf及ve-cadherinmrna转录水平;流式细胞术检测诱导后细胞中cd31+和ve-cadherin+细胞比例;matrigeltm基质胶内进行细胞管腔形成实验,并拍照统计管腔形成数目、分支节点数及管腔长度并进行比较。比较阻断erk1/2磷酸化过程对pdlscs在两种条件下内皮向分化能力的差异。3研究结果:3.1原代培养纯化后细胞呈长梭形,呈放射状排列,长轴之间近于平行。鉴定细胞发现细胞具有克隆形成能力;流式细胞术结果显示纯化所得细胞高表达间充质干细胞标志物,低表达造血干细胞标志物;成骨及成脂诱导实验显示细胞具有成骨和成脂分化潜能。3.2pdlscs内皮向分化诱导后检测内皮向分化指标,real-timepcr和流式细胞术结果显示,对于炎症微环境中诱导分化的pdlscs,ve-cadherin和vegfmrna转录水平、cd31+和ve-cadherin+细胞比例显著高于正常环境培养条件下,管腔形成能力也明显高于正常环境培养条件下内皮向分化诱导的pdlscs。3.3westernblotting显示pdlscs经过内皮向分化诱导,erk1/2磷酸化水平升高,其中1h和3h显著高于诱导前。选取诱导后1h这一时间点,分别在正常及炎症微环境诱导和加入u0126后进行内皮向分化诱导,发现炎症微环境中诱导的p-erk1/2水平高于正常条件下,而u0126可以阻断诱导引起的erk1/2的磷酸化过程。3.4real-timepcr和流式细胞术结果显示,加入u0126后,pdlscs的内皮细胞相关mrna转录水平、蛋白表达水平以及管腔形成能力均明显降低,表明阻断了erk1/2磷酸化过程会抑制pdlscs的内皮向分化过程。但炎症微环境中阻断erk1/2磷酸化对内皮向分化过程的抑制并不完全。结论:pdlscs被vegf和fgf诱导可以向内皮细胞分化,这一过程受erk通路调控,阻断erk通路可以抑制pdlscs的内皮向分化。炎症微环境下进行分化诱导会促进pldsc内皮向分化过程,阻断erk通路可以部分抑制pdlscs炎症微环境下内皮向分化过程。