α1抗胰蛋白酶主要由肝细胞合成，分泌到血液中，它是血清中的主要蛋白酶抑制剂，其作用主要是保护肺组织免受蛋白酶水解，尤其是中性粒细胞弹性蛋白酶的水解破坏。AAT缺乏症是一种常染色体隐性遗传病，发病率约1/2000～5000，它的典型临床表现是早发性肝脏疾病和肺气肿。AAT缺乏症是由于编码AAT蛋白的基因突变引起AAT分泌障碍所致，最常见的引起AAT缺乏症的突变为Z型突变，占临床病例的95％以上，该突变编码的蛋白为AAT Z突变体。在前期研究中我们发现ring-finger结构域家族泛素连接酶gp78可以促进ATZ降解，本研究进一步观察另一种ring-finger结构域家族E3，Hrd1对ATZ水平的影响。　　 目的：　　 观察Hrd1是否可以促进ATZ的降解，并探讨其降解的机制。同时观察Hrd1介导的ATZ降解是否影响细胞的功能。　　 方法：　　 构建ATZ、Hrd1、Hrd1的E3活性突变体Hrd1C1A等真核表达质粒，合成siRNA-Hrd1，转染HEK 293T或HepG2细胞；逆转录聚合酶联反应和免疫印迹检测mRNA及蛋白水平的变化；流式细胞检测细胞荧光强度的变化；放线菌酮示踪、蛋白酶体抑制实验观察Hrd1对ATZ表达水平影响的作用机制；免疫细胞化学和免疫荧光观察细胞形态和蛋白定位；免疫共沉淀和蛋白片段互补实验确定Hrd1和ATZ的相互作用；荧光显微镜观察和原位末端脱氧核苷酸转移酶标记法染色检测细胞形态和凋亡情况。　　 结果：　　 1．Hrd1表达降低细胞内ATZ的总体水平　　 HEK 293T细胞共转染ATZ和Hrd1的cDNA，设立ATZ共转染空载体对照，24 hrs后用Triton X-100裂解液裂解细胞并离心，IB 检测裂解液上清。与对照组相比，共表达Hrd1后ATZ在上清中的总量变化不明显，但高分子量ATZ水平明显降低。由于高分子量蛋白聚集体容易形成不溶性沉淀，我们推测Hrd1可能增加ATZ的可溶性并降低沉淀中ATZ水平。为了验证这一设想，我们用IB分别检测细胞上清和沉淀中的ATZ，结果发现Hrd1能明显降低沉淀中ATZ的水平。　　 2．下调内源性Hrd1表达能稳定细胞内ATZ水平　　 利用siRNA技术，合成siRNA-Hrd1寡聚核苷酸，并将ATZ和siRNA-Hrd1共转染HEK 293T细胞，同时设立阴性对照。IB结果显示，与对照组相比，siRNA-Hrd1能使细胞内ATZ水平增高，尤其是SDS不溶部分的ATZ水平。　　 3．Hrd1降低细胞内ATZ水平与E3活性有关　　 Hrd1属于ring-finger结构域家族E3，它的E3活性依赖其指环结构的完整性。为了观察细胞内ATZ水平的降低是否与Hrd1的E3活性有关，我们分别观察野生型Hrd1和E3活性缺失体Hrd1C1A对细胞内ATZ水平的影响。HEK 293T细胞共转染ATZ与Hrd1或Hrd1C1A的cDNA，24 hrs后免疫细胞化学结果显示，野生型Hrd1表达多的细胞，ATZ聚集减少。但Hrd1C1A表达多的细胞，ATZ聚集未见减少。IB结果同样显示，Hrd1明显降低沉淀中ATZ水平，而Hrd1C1A对沉淀中ATZ水平无明显影响。上述结果提示：Hrd1降低细胞沉淀中ATZ水平是其E3活性依赖的。　　 4．Hrd1促进ATZ的降解　　 细胞内蛋白水平受合成和降解两方面因素影响，合成减少或/和降解增加均可以导致蛋白总体水平的降低。为了观察Hrd1 引起的细胞内ATZ 水平的降低是否是由于ATZ的降解增加所致，我们使用了CHX (100 μg/ml) 抑制蛋白质合成，然后观察加入CHX后不同时间细胞内ATZ的水平，以此来了解ATZ的降解情况。结果发现，Hrd1 能明显促进SDS不溶部分ATZ的降解。同时还发现，共表达Hrd1的细胞培养上清液中ATZ的分泌减少，这进一步说明，细胞内ATZ的减少不是因为它的分泌增加，而是因为它的降解增加所致。　　 5．Hrd1促进ATZ降解依赖其E3活性　　 为了进一步明确Hrd1介导 ATZ的降解是否与其E3 活性有关，我们分别将HEK 293T细胞共转染ATZ和Hrd1或Hrd1C1A的cDNA，24 hrs 后在细胞的培养上清液中加入CHX，然后检测各时间点细胞内的ATZ 水平。结果发现，Hrd1C1A 能增加ATZ的可溶性，但不能促进SDS 不溶部分ATZ的降解。提示Hrd1介导的ATZ降解与其E3活性有关。　　 6．Hrd1 增加ATZ的泛素化　　 细胞内的蛋白降解主要有两种途径：泛素-蛋白酶体途径 (ubiquitin-proteasome pathway，UPP)和溶酶体途径。由于Hrd1是一种ring-finger结构域家族的E3，我们首先考虑Hrd1通过UPP途径促进ATZ的降解。内质网中的蛋白底物经过UPP降解时首先被泛素化修饰，然后经过逆向转运到达26S的蛋白酶体，被蛋白酶体中的蛋白水解酶降解。为了明确UPP是否参与了Hrd1 介导的ATZ 降解，我们观察了Hrd1 对ATZ 泛素化的影响。结果发现在没有蛋白酶体抑制剂MG132存在的情况下，Hrd1 可明显降低多聚泛素化ATZ；在细胞的培养上清液中加入MG132，作用4 hrs 后收集细胞，共转染ATZ和野生型Hrd1组出现多聚泛素化ATZ，而单独转染ATZ 或者共转染ATZ与Hrd1C1A 组则没有观察到明显的ATZ 泛素化。该结果提示Hrd1可以促进ATZ的泛素化，这种作用也是E3活性依赖的。　　 7．含缬酪肽蛋白(valosin-containing protein,VCP) 参与Hrd1介导的ATZ降解　　 ATZ 是内质网 (endoplasmic reticulum，ER) 腔内的蛋白，如果经过UPP降解，需要从ER 逆向转运至细胞浆，然后由26s蛋白酶体降解，即所谓的内质网相关蛋白降解（ER-associated degradation，ERAD）。在ERAD过程中，VCP在蛋白底物由ER转运至细胞浆的逆向转运中起着重要的作用。我们进一步观察了VCP是否也参与Hrd1 介导的ATZ降解。我们共转染ATZ，Hrd1和VCP的突变体VCPQQ的cDNA。结果显示，与对照组相比，VCPQQ阻碍了Hrd1介导的ATZ降解，提示VCP参与了Hrd1介导的ATZ的降解。　　 8.溶酶体通路可能参与Hrd1介导的ATZ降解　　 为了观察溶酶体通路是否参与Hrd1介导的ATZ降解，我们共转染ATZ和Hrd1，观察溶酶体膜稳定剂氯化铵对ATZ水平的影响，发现加入氯化铵后，出现高分子量ATZ的聚集。我们同时构建了在ATZ的信号肽前方加入带有绿色荧光蛋白 (green fluorescence protein，GFP) 标签的ATZ表达载体，改变ATZ在细胞内质网中的定位。将表达GFP-ATZ和Hrd1的质粒共转染HEK 293T细胞，设立共转染GFP-ATZ和空载体、GFP和Hrd1及GFP和空载体的对照。24 hrs后荧光显微镜观察，与对照组相比，共转染Hrd1组GFP-ATZ绿色荧光强度明显降低；流式细胞检测同样发现，共转染Hrd1后，GFP-ATZ的荧光强度降低。而在转染GFP的对照组中，Hrd1对GFP的荧光强度没有明显影响，IB结果也显示Hrd1不能降低细胞上清和沉淀中GFP的表达水平。　　 9．Hrd1和ATZ存在相互作用　　 前述实验结果提示 Hrd1 可以通过UPP促进ATZ的降解。我们进一步观察了ATZ 与Hrd1之间是否存在相互作用。共转染ATZ和Hrd1或Hrd1C1A的cDNA，免疫荧光双标结果显示ATZ 与Hrd1 在细胞内存在共定位。免疫共沉淀结果提示ATZ 与Hrd1 及Hrd1C1A 均存在直接的相互作用，该结果提示ATZ 与Hrd1的相互作用与其E3 活性无关。为了进一步证实ATZ和Hrd1之间的相互作用，我们构建载体，将ATZ和Hrd1的N端分别连上荧光素酶的C端和N端。PCA实验观察共表达两种重组载体的细胞的荧光素酶活性。与对照组相比，实验组荧光素酶活性明显增高。该结果进一步证实Hrd1和ATZ之间存在相互作用。　　 10.Hrd1 降低ATZ的细胞毒性　　 ATZ的聚集可以引起肝细胞毒性，我们在体外HEK 293T和HepG2的细胞模型中同样观察到ATZ具有细胞毒性。同时我们观察了Hrd1 介导的ATZ 降解对ATZ细胞毒性的影响。免疫荧光结果显示单独表达ATZ的细胞或者共表达ATZ 与Hrd1C1A的细胞变圆、突起缩短、细胞核分叶、固缩、碎裂或消失；共表达Hrd1 后，细胞形态和细胞核趋于正常。统计分析ATZ 阳性细胞核的完整性结果显示，Hrd1的表达有助于维持ATZ 阳性细胞核的正常形态；TUNEL染色结果同样显示共表达Hrd1后，细胞凋亡减少，而Hrd1C1A没有这种作用；提示Hrd1 可以降低ATZ的细胞毒性，这种作用是E3活性依赖的。　　 结论:　　 以上研究结果表明，Hrd1作为E3可以促进ATZ通过UPP降解并增加ATZ的可溶性，降低ATZ的细胞毒性作用，促进细胞存活。提示Hrd1可能是治疗AAT 缺乏症肝脏并发症的潜在药物靶点。